作者：俊波 博士苑（微信公众号）

circRNA和lncRNA是近期的研究热点，通过RNA深度测序结合软件分析预测出众多circRNA或者lncRNA，但是如何进一步证明挑选出来circRNA或者lncRNA的真的是circRNA或者lncRNA呢？下面将详细介绍证明RNA是circRNA或者lncRNA的流程。

一预测circRNA和lncRNA

一般通过RNA深度测序结合软件分析预测circRNA（如图1， Zhang et al. 2014）和lncRNA。通过测序结果鉴定circRNA的软件有find_circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA_finder、CIRI 、CircBase等（Glažar et al. 2014；Hansen et al. 2016）。利用测序结果鉴定lncRNA的软件有PLEK（Li et al. 2014）、 CPAT、CNCI、lncScore（Zhao et al. 2016）等。Zheng et al.（2016）通过RNA深度测序检测到19071个已发现的circRNA和8225个新circRNA。Lee et al.（2011）利用RNA深度测序检测到1884个新多外显子转录本，其中81%的编码潜力低，很可能是lncRNA。通过RNA深度测序结合软件分析预测的circRNA或者lncRNA假阳性较高，需要通过实验进一步验证。

图1 RNA深度测序发现新的circRNA

二验证RNA是circRNA

★测序验证circRNA的剪接区

通过RNA深度测序结合软件分析预测出circRNA后，通常先用RT-PCR产物通过Sanger测序检测circRNA的头尾剪接区，如图2（Zheng et al. 2016）所示。然而头尾剪接接可以通过反式剪接或者基因组重排产生，因此需要通过RT-PCR、RNase R耐受性检测进一步验证预测的circRNA是否真的是circRNA。

图2 Sanger测序检测circRNA的剪接区

★RT-PCR排除基因重组

RT-PCR排除基因重组一般要用两对引物，一对发散引物检测circRNA和重组基因，另一对收敛引物检测mRNA和circRNA，如图3所示（Li et al. 2015），除了用cDNA为模板检测，还要用基因组DNA（gDNA）为模板检测。用cDNA做模板两对引物均有产物，用gDNA做模板只有收敛引物具有产物，则表明检测的RNA不是由基因重组产生的，以cDNA做模板和以gDNA做模板均只有收敛引物具有产物，则检测的基因不表达circRNA，也没有在检测区域发生基因重组，如图3所示（Memczak et al. 2013）。RT-PCR也可以检测circRNA的表达水平。

图3 circRNA引物设计示意图

图4 RT-PCR排除基因重组

★RNase R耐受性检测排除反式剪接和基因组重排

由于RNase R可以消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构和3＇突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子，可以通过qPCR和Northern blot检测目的RNA对RNase R的耐受性，证明其是circRNA，排除反式剪接和基因组重排的可能性。经过RNase R处理，circRNA的含量几乎不变，而单链线状RNA被降解，图5（Li et al. 2015）显示qPCR检测的结果，图

6（Memczak et al. 2013）显示Northern blot检测的结果。Northern blot检测可以排除PCR的假阳性，通常用探针检测剪接区。

图5 qPCR检测circRNA对RNase R的耐受性

图6 Northern blot检测circRNA对RNase R的耐受性

三验证RNA是IncRNA

★开放阅读框分析

用软件从RNA深度测序结果中预测lncRNA时，通常会将开放阅读框短于300nt（氨基酸残基少于100个）的转录本识别为lncRNA，但是少数短于300nt的开放阅读框能够表达出多肽。最近发现很多含有短开放阅读框（short open reading frame, sORF）的lncRNA能够编码小肽（micropeptide，也译作微肽），如被认为是lncRNA的豆科植物早期结瘤素40（early nodulin 40, ENOD40）基因的转录产物能够编码一种12肽和一种24肽（Rohrig et al. 2002），果蝇中被认为是lncRNA的 pri（polished rice）能够编码3种11肽和一种32肽（Kondo et al. 2007）。因此，需要将可以忽略的开放阅读框调到更小，一般小于30nt的开放阅读框可以认为没有编码能力。故没有大于或等于30nt的开放阅读框的长于200nt的RNA（长度大于）是lncRNA，而具有大于或等于30nt的开放阅读框的长于200nt的RNA需要进一步证明。

可以用NCBI的ORF finder网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析开放阅读框，网站的界面如图7所示。
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图7 ORF finder网站的界面

★体外翻译实验

一般通过体外翻译实验检测RNA能否编码多肽。新发现的RNA Chaer具有开放阅读框（图8a下方的红色区域表示开放阅读框），体外翻译实验表明Chaer与lncRNA Hotairx相似，不具有编码多肽的能力（图8b，较淡的条带是背景），因此是Chaer是lncRNA（Wang et al. 2016）。
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图8 体外翻译实验

以上就是验证RNA是circRNA或者lncRNA的流程，你学会了吗？

参考文献：

1、Glažar P, Papavasileiou P, Rajewsky N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 2014, 20(11):1666-70.

2、Hansen TB, Venø MT, Damgaard CK et al. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Res. 2016, 44(6):e58.

3、Kondo T, Hashimoto Y, Kato K et al. Small peptide regulators of actin-based cell morphogenesis encoded by a polycistronic mRNA. Nat Cell Biol. 2007, 9(6):660-665.

4、Lee JH, Gao C, Peng G et al. Analysis of Transcriptome Complexity Through RNA Sequencing in Normal and Failing Murine Hearts. Circ Res. 2011, 109(12):1332-13341.

5、Li A, Zhang J, Zhou Z. PLEK: a tool for predicting long non-coding RNAs and messenger RNAs based on an improved k-mer scheme. BMC Bioinformatics. 2014, 15:311.

6、Li Z, Huang C, Bao C et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat Struct Mol Biol. 2015, 22(3):256-264.

7、Memczak S, Jens M, Elefsinioti A et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013 Mar 21;495(7441):333-338.

8、Rohrig H, Schmidt J, Miklashevichs E et al. Soybean ENOD40 encodes two peptides that bind to sucrose synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002, 99(4):1915-1920.

9、Wang Z, Zhang XJ, Ji YX et al. The long noncoding RNA Chaer defines an epigenetic checkpoint in cardiac hypertrophy. Nat Med. 2016, 22(10):1131-1139.

10、Zhang XO, Wang HB, Zhang Y et al. Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization. Cell. 2014, 159(1):134-147.

11、Zhao J, Song X, Wang K. lncScore: alignment-free identification of long noncoding RNA from assembled novel transcripts. Sci Rep. 2016, 6:34838.

12、Zheng Q, Bao C, Guo W et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016, 7:11215.