• 转录组测序筛选差异表达的circRNA；
• 通过网络数据库预测circRNA可能结合的miRNA；
• CircRNA与miRNA结合的进一步验证（荧光素酶报告试验）；
• miRNA靶基因的筛选、验证和功能研究；
• 构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络。

下面以近期发表的一篇论文为例，了解circRNA的主要研究思路。

主要研究内容：

通过对3名骨关节炎患者和3名健康对照的软骨组织进行转录组测序（ribosomal RNA-depleted method），获得与骨关节炎相关的circRNA表达特征。CircSERPINE2在骨关节炎患者软骨组织中表达下调，并在细胞系中得到证实。CircSERPINE2在细胞中的干扰实验证明，CircSERPINE2下调促进软骨细胞的凋亡，并使得胞外基质的合成和分解代谢不平衡。

骨关节炎患者和健康对照的软骨组织miRNA测序分析发现，191个miRNAs在骨关节患者的软骨组织中上调。通过miRanda，TargetScan等数据库预测CircSERPINE2上的miRNA识别元件，最终聚焦到7个miRNAs上；并通过一系列的细胞实验（包括RNA pull down, a luciferase reporter assay, biotin-coupled microRNA capture and fluorescence in situ hybridisation等）证明CircSERPINE2与miR-1271的靶向吸附作用。结合miRNA的测序分析结果，证实CircSERPINE2通过竞争性地与miRNA-1271结合，从而调节E26 transformation-specific (ETS)-related gene (ERG)表达；并在兔实验模型中证实，注射腺病毒CircSERPINE2可以缓解其骨关节炎症状。