最近，2016国家自然科学基金项目结果已经公布，数据显示circRNA已经逐渐成为研究的热点，与circRNA相关的项目共获批63项，而去年只有13项。且今年获批的项目中针对circRNA表达量或功能研究的明显增多，说明circRNA研究已过渡到功能研究上。

前几天小编已经给大家简单综述了有关circRNA研究的相关内容（可以点击文末阅读原文查看），我们复**一下要点：circRNAs是近年来发现的一类新的具有调控功能的非编码RNA，目前研究认为circRNA主要通过三种机制发挥作用（1）顺式调控亲本基因的表达；（2）作为miRNA的海绵吸附体调控基因的表达（ceRNA）；（3）通过和蛋白形成复合体来发挥生物学功能[1]。

下面，我们将通过案例为大家详细讲解，如何开展circRNA的ceRNA调控机制研究。

研究案例：
一、研究思路

二、研究结果
1、正常组织及癌组织的circRNA分析
纳入6个正常组织 (brain, heart, liver,lung, colon and stomach)、1对原发性肝癌的癌及癌旁组织、6个癌组织(CRC, GC, KCA, BLCA, BCand PRAD)进行RNA-seq。共鉴定67,358个circRNAs，80%的circRNAs包含protein-coding exons，circRNAs的中位数长度为~500 nt，circRNAs在不同组织类型中存在不同的表达趋势。qRT-PCR with RNase R treatment及sanger sequencing鉴定到20个新circRNAs。

2、circRNA特性分析
5,955个主基因共生成20,530 circRNAs，说明1个基因至少产生1个circRNA。然而对于1个基因，可能只有1个主效表达的circRNA。以5’ CR (circular ratio) > 0.2; 3’ CR > 0.2; SRPBM > 1为阈值，共筛选到990个高丰度circRNAs（circRNAs表达量显著高于其线性），其中circHIPK3显著富集。circHIPK3的表达量、稳定性、定位、FISH分析表明：circHIPK3在人类细胞中高丰度且稳定表达。

3、circHIPK3来源于HIPK3 exon2
为分析circHIPK3的形成机制，首先进行比对分析，在HIPK3 circularizing exon左右2段各发现了一个repeated Alu elements。当缺少1或2个Alu elements时，并不能形成环化，说明2个repeated Alu elements对于circHIPK3的形成是必需的。CRISPR/Cas9实验表明：与Alu repeats互补long flanking introns对于circHIPK3的形成是必需的。

4、沉默circHIPK3可抑制细胞增值
分别采用siRNA及CRISPR/Cas9技术进行loss-of-function研究，结果表明：circHIPK3的沉默可对细胞增值产生抑制作用。

5、circHIPK3是作为多个miRNA的“海绵”
基于前人研究及RIP结果，说明AGO2与circHIPK3存在互作关系。此外，荧光素酶活性分析说明：circHIPK3可能是一个AGO2和miRNAs的结合平台。随后，采用luciferase screening for a miRNA library验证miRNAs和circHIPK3的互作。其中，9 miRNAs (miR-124,miR-152, miR-193a, miR-29a, miR-29b, miR-338, miR-379, miR-584 and miR-654) 可降低荧光素酶活性，然而并没有显著降低circHIPK3的表达水平。虽然这些miRNAs中都包含至少一个circHIPK3的结合位点，但miRNAs的点突变实验并没有对荧光素酶活性产生影响，上述结果表明：circHIPK3可能是这些miRNAs的“海绵”。

miR-124, miR-193, miR-379 andmiR-654的过表达可显著抑制HEK-293T细胞生长，其中miR-124表现出最明显的抑制作用。circHIPK3 knockdown可诱导miR-124靶基因（IL6R和DLX2）的下调表达；circHIPK3过表达可削弱miR-124诱导的增值抑制作用。此外，进行circHIPK3 and miR-124的组织特异性表达分析，其在脑组织中显著高表达。综述所述，circHIPK3通过直接结合miR-124来抑制其活性。

结论：
circHIPK3来源于HIPK3 exon2，且2个repeated Alu elements对于circHIPK3的形成是必需的。siRNA及CRISPR/Cas9抑制circHIPK3的表达，进而抑制细胞增值。circHIPK3过表达可削弱miR-124诱导的增值抑制作用。circHIPK3通过直接结合miR-124来抑制其活性。

上述研究思路：从circRNA入手进行ceRNA机制研究。后续将为大家解读另一种研究思路：从miRNA入手进行ceRNA机制研究，敬请期待~~~~

参考文献
1. Jeck, W.R. and N.E. Sharpless, Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology,2014. 32(5): p. 453-61.
2. Zheng, Q., et al., Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulatescell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016. 7(11215).