图1

图1：长非编码RNA-心肌梗死相关转录本(MIAT)的体内和体外表达模式。

A：用RNA荧光原位杂交(FISH)检测MIAT的表达。样品还与MIAT正义探针(阴性对照[NC])和U6探针杂交，以确认RNA-FISH特异性。对神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(ONL)和视网膜色素上皮(RPE)层进行50μm RNA-FISH定量，以显示非糖尿病组和糖尿病组之间MIAT表达的差异。

B：RNA-FISH检测视网膜细胞中MIAT的表达。细胞核，蓝色；MIAT，红色；微管蛋白，绿色。检测微管蛋白作为细胞质标记物来显示细胞边界。采用Scale bar，10μm.

C：定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测糖尿病诱导后2，4，6个月大鼠视网膜中MIAT水平。

D：qRT-PCR检测db/db小鼠及其非糖尿病对照组视网膜中MIAT、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)的水平。

E：qRT-PCR检测不同临床样品中的MIAT水平。DM表示糖尿病。

图2

图2：心肌梗死相关转录本(MIAT)敲除可改善视网膜功能。

A：组大鼠玻璃体腔内注射10μL Ad-SCR shRNA或MIAT shRNA病毒载体，观察时间。采用定量逆转录聚合酶链反应检测MIAT水平。

B：糖尿病诱导后6个月，记录非糖尿病大鼠(野生型)、糖尿病大鼠、注射Ad-SCR shRNA的糖尿病大鼠和注射Ad-MIAT shRNA的糖尿病大鼠的视网膜电图(ERG)。显示了具有代表性的ERG和振荡电位(OPs)波。对a，b，ops波的振幅进行统计学分析。*与野生型非糖尿病组比较有显著性差异。#DR组与DR+MIAT shRNA组有显著性差异。

C：显示糖尿病诱导6个月后TUNEL检测的代表性图像和定量结果。细胞核，蓝色；TUNEL阳性细胞，红色。比例尺，50μm。*与野生型非糖尿病组相比有显著性差异。#标记实验组之间有显著性差异。

D：对活化的caspase-3进行免疫荧光分析，以评估视网膜细胞凋亡。展示了一个有代表性的图像。比例尺，50μm.

E：Western blotts检测裂解的caspase-3，磷酸化Akt(Akt-pho)和总Akt的水平。检测微管蛋白作为负载对照。显示了具有代表性的免疫印迹和定量结果(n=4)。

1、DAPI：6-二胺基-2-苯基吲哚；

2、DR：糖尿病视网膜病变；

3、NS：无显著性差异。

4、*：与非糖尿病组相比有显著性差异。

5、#：被标记组之间的显著差异。

图3

图3：心肌梗死相关转录本(MIAT)敲除减轻视网膜血管损伤。

A：进行视网膜胰蛋白酶消化，检测周细胞和脱细胞毛细血管的变化。红色箭头表示无细胞毛细血管。周细胞和脱细胞毛细血管在每视网膜30个随机场中定量，并取平均值。比例尺，25μm.

B：大鼠灌注伊文思蓝染色2小时。用荧光显微镜检测平台式视网膜的荧光信号。展示了一个有代表性的图像。同时，对伊文思蓝渗漏进行量化。白色瘢痕条，100μm；黄色瘢痕条，25μm.

C：Western blotts检测肿瘤坏死因子-α，血管内皮生长因子和细胞间粘附分子-1的表达。检测微管蛋白作为负载对照。显示有代表性的免疫印迹和定量数据(n=4)。

图4：心肌梗死相关转录本(MIAT)敲除在体外影响内皮细胞功能。

B：RF/6A细胞与JC-1探针在37°C孵育30分钟，离心，洗涤，转移到96孔板上，使用荧光板阅读器进行测定，并使用荧光显微镜进行观察。比例尺，50μm.

C：显示Ki67染色的代表性图像以及Ki67阳性细胞的定量。Scale bar，10μm.

D：用伤口愈合实验评估细胞迁移。在肿瘤坏死因子-α(10 ng/mL)处理后0、24和48小时拍摄图像。水平线表示伤口边缘。通过测量受伤区域内的细胞数量来估计迁移。数据显示为与对照组相比的相对变化，未进行肿瘤坏死因子-α治疗。将10 0μm.

E：RF/6A细胞接种于基质上，用肿瘤坏死因子-α(10 ng/mL)刺激。肿瘤坏死因子-α处理24h后观察管状结构。对每一场的平均管形成数进行统计学分析(n=50)。比例尺，100μm。

图5

图5：心肌梗死相关转录本(MIAT)调节miR-150-5p靶基因血管内皮生长因子(VEGF)的表达。

A：用miRTarBase预测VEGF为miR-150-5p的靶基因。显示了miR-150-5p结合位点在血管内皮生长因子上的位置(转录本ID：NM_0010253)。

B：VEGF(RLuc-VEGF-WT)和突变体(RLuc-VEGF-Mut)被克隆到荧光素酶载体的下游。荧光素酶活性检测采用双荧光素酶测定法。

C：rLuc-VEGF-WT和miR-150-5p与MIAT质粒或载体共转染RF/6A细胞，以验证MIAT的竞争内源性RNA活性。直方图显示转染48小时后测得的荧光素酶活性数据。

D和E：RF/6A细胞转染不同组合的MIAT和miR-150-5p模拟。采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达。(+)对应于100 ng的MIAT结构或20 ng的miR-150-5p模拟。(+)相当于200 ng MIAT结构或50 ng miR-150-5p模拟。数据显示为均值±扫描电镜，并表示为与对照组相比的相对变化(n=4)。对照组显示为黑色。