Analysis of human ES cell differentiation establishes that the dominant isoforms of the lncRNAs RMST and FIRRE are circular
对人类胚胎干细胞分化的分析表明，lncRNA RMST和FIRRE的优势亚型均为环状
期刊：BMC Genomics. （IF=3.501）
发表单位：纽卡斯尔大学遗传医学研究所等
导 读
本篇通过体外培养的人胚胎干细胞系（ES），表征在干细胞早期分化阶段的circRNA表达谱。主要包括：
（1）描述circRNA的时间动态，包括剪接类型、表达丰度等，表明整体水平随时间增加；
（2）表征显著时间模式的circRNA特征，包括剪接点的基因组分布、编码或非编码基因来源等，并表明非编码基因的circRNA发挥更多的调控功能；
（3）识别了两个关键的circRNA，并描述其在ES早期分化阶段的特点，并证实circRNA是其亲本lncRNA发挥功能的主要形式；
（4）qPCR验证表达谱，RNase R试验验证环状结构。
摘 要
背景：环状RNA（circRNA）主要来自蛋白质编码基因，有些可以充当microRNA海绵或转录调节因子。在人类发育过程中已确定了circRNA水平的变化，这可能在功能上很重要，但目前尚缺乏针对谱系的分析。为了解决这个问题，对3D层压视网膜分化90天的人胚胎干细胞（ES）进行了RNAseq分析
结果：观察到circRNA的表达、大小和外显子计数均有所增加，在第45天circRNA水平达到稳定。平行统计分析，控制样本和位点特异性效应，识别出239个表达变化不同于转录组范围模式的circRNA，但随着时间的推移，这些circRNA也大量增加。来自长链非编码RNA（lncRNA）中提取的circRNA占其来源基因座转录本的比例明显高于编码基因的circRNA。最丰富的circRMST:E12-E6，在分化过程中伴随着同工型转换显示出大于100倍的增加，并且在许多成人组织中占RMST转录本的99％以上。第二丰富的circFIRRE:E10-E5占人类胚胎干细胞分化FIRRE转录本的98%，是39个FIRRE circRNA之一，其中许多包含多个未加注释的外显子。
结论：结果表明，在人类ES细胞分化过程中，circRNA水平的变化主要受全局控制。RMST和FIRRE，这两个分别在神经发生和染色体域拓扑结构中有既定作用的基因，被处理成只有微小线性物种的环状lncRNA。
前 言
circRNA可以充当miRNA海绵，有些可以增强自身启动子的活性，有些可以促进蛋白质组的生长，其数量与疾病相关。circRNA几乎总是与来自同一基因座的线性转录本共表达，并且已证明其表达在发育、增殖和衰老过程中相对于线性RNA有所增加。来自同一基因座的线性和circRNA的不同表达模式已在多个神经元组织中、不同的发育阶段和在不同物种中得到了表征，这为线性和环状同工型的独立调节提供了间接证据。
目前尚缺乏对细胞谱系中circRNA丰度变化的长期分化系列的分析。本篇研究使用培养90天的人类ES细胞（H9系）分化为3D层压视网膜，并在3个时间点（0、45、90天）观察circRNA表达谱。发现了编码基因和非编码基因之间circRNA水平的显著差异，并表明两种在胚胎早期发育中具有已知功能的lncRNA，RMST和FIRRE，可能主要作为circRNA发挥功能。
材料方法
人类胚胎干细胞系H9系的第34-35世代，进行分化培养，于0、45、90天提取RNA测序。
Tophat将clean reads映射到人类基因组（hg19），GENCODE用于circRNA参考注释，PTESFinder进行无注释的circRNA剪接点识别，使用BEDTools确定RNA编辑位点。
HTSeq用于定量转录本，DESeq2鉴定差异表达circRNA，基因本体（GO）分析使用Panther进行。UCSC基因组浏览器用于基因组可视化。
更详细材料和方法可以在在线补充材料中找到。
结 果
1 、在分化的前45天中，circRNA水平急剧增加
作者首先鉴定了circRNA类型并描述了识别的circRNA种类随细胞发育的关系。共鉴定了58528个不同的circRNA。在第0-45天，circRNA类型显示出约4-5倍的显著增加，以及circRNA供体和受体外显子之间的基因组跨度以及circRNA包含的外显子数量显著增加，超过70％的circRNA仅在分化过程中发现，同时促RNA环化蛋白的表达也增加。表明在细胞发育过程中，越来越多种类的circRNA产生以发挥功能。在第45-90天之间，circRNA水平趋于平缓。
可以看到，细胞分化过程早期，细胞活性被极大地激活，产生极大数量的调控分子应对胚胎早期发育的功能。
2 、circRNA表达变化是通过整体上调和基因座特异性转录水平来实现
在鉴定了circRNA种类的时间动态后，继续关注丰度水平的调节。作者在跨时间点之间关注了总circRNA水平以及基因座特异性水平的变化。共识别了239种显著的circRNA，并且均处于上调水平。
也就是说，这些显著活跃的circRNA均促进了细胞分化的正调控。
图4，DE基因的表达水平和编码能力。a、b，热图显示了239个DE转录本的剪接点频率；c、d，所有产生circRNA的编码基因或非编码基因的circRNA剪接点与总circRNA剪接点的关系。
3 、非编码circRNA产生基因比编码基因具有更高的圆/线性比
在识别了整体表达趋势后，作者接下来关注了circRNA的基因组来源，以定位circRNA类型。尽管239种重要的DE circRNA大多数来自编码基因，但最丰富的来自RMST，一种已知参与神经干细胞周期调控的lncRNA，第二丰富的来自lncRNA FIRRE，与小鼠脂肪生成和染色体核定位有关。作者特别地发现非编码基因的circRNA在其起源位点的总转录本中所占比例要高于编码基因的circRNA，尽管非编码基因通常以较低水平表达，但RNA产物圆形/线性比远高于编码基因。
结果暗示了非编码基因的circRNA更重要。由于RMST和FIRRE都参与了发育过程，随后的篇幅作者就这两个基因展开分析。
4、 circRMST:E12-E6可占RMST转录本的99％以上，上调与启动子变化一致
首先对RMST的circRNA的表达谱及剪接点频率作了描述。总的来说，在细胞分化过程中，circRMST的表达水平相比其同工型显著增加，并且E12-E6剪接体在全时期均明显。通过确定潜在的转录起始位点，其活性和circRNA剪接体的表达趋势一致。qPCR分析验证了分化时期circRMST的表达。总之，E12-E6 circRNA细胞分化过程中最丰富的RMST亚型。
图5，分化细胞中RMST的circRNA。a，外显子剪接同工型及表达水平分布；b，RMST的外显子结构示意图；c，E12-E6 circRNA及mRNA前体的动态表达谱；d、e，qPCR验证RMST circRNA表达。
5 、lncRNA FIRRE被下调，分化后其主要转录本为环状
其次是对FIRRE的circRNA的表达谱及剪接点频率的描述。总的来说，尽管lncRNA FIRRE主要为下调状态，但是观察到异质性，表明存在单个启动子区域的活性差异。FIRRE的E10-E5存在大量的反向剪接连接，表明存在单个显性circRNA，并观察到E10-E5剪接体表现出显著的高表达水平。在分化细胞中，来自丰富的中央外显子的超过98％的表达来自circRNA。作者还根据测序reads的分布发现，FIRRE转录本可能包含其它未被注释的外显子，并继续从RNAseq数据推断重排转录物结构的存在。分析发现，FIRRE中内部序列重复的点矩阵也确定了E5-E10区域包含了大多数DCC重复序列，已知这些重复序列起着核定位信号的作用。最后使用qPCR验证了E10-E5 circRNA是体内分化过程中最丰富的FIRRE亚型。
6、 RMST E12-E6占成人神经RMST表达的99％以上
4、5两部分内容主要在体外分化的细胞中表征了circRMST和circFIRRE的特征，已经确定两个功能重要的lncRNA在ES分化过程中几乎只产生环状同工型。作者还在成人组织中做了表征，探究它们在成体中是否存在一致的效应。
在心脏、肺和肾脏等组织中，RMST E12-E6 circRNA均存在丰富的表达，神经组织中最为明显。但是相对于ES细胞，circFIRRE在成年组织中没有富集，对公开的RNAseq数据集进行分析，也证实了FIRRE外显子的低表达。（很显然，circRNA表达存在组织和发育阶段特异性）
7、 circRNA外部的RMST和FIRRE外显子对RNase R敏感
由于上述关于RMST和FIRRE的环形剪接体的推断，是通过生信分析得出的，为了证实实际确实如此，作者通过试验验证两个基因的转录本在ES细胞中的环状结构。简单来说，通过RNase R消化处理，观察到RMST E12-E6和FIRRE E10-E5对RNase R的抗性，而其它线性RNA或外显子区域的表达水平大都出现显著下降。因此该RNase R消化试验证实了RMST E12-E6和FIRRE E10-E5的稳定环形剪接体结构。
讨 论
本篇研究对人胚胎干细胞（ES）视网膜分化进行了深度测序，以研究细胞谱系中circRNA表达的变化，并确定具有潜在功能重要性的circRNA。观察到ES 分化早期circRNA类型和丰度在转录组范围内显著增加，特别是在开始的45天内，这与circRNA在分化过程中的整体调控水平是一致的。
研究观察到的最丰富的circRNA，以及随时间变化而表现出最显著变化的circRNA，来自lncRNA RMST，与神经元分化有关，并且RMST的转录产物中超过99％为circRNA。同样高水平表达的lncRNA FIRRE在人ES细胞分化过程中也主要以circRNA存在，为已报道的成熟FIRRE转录本相对于pre-mRNA的稳定性提供了解释。未来对于这两个非编码，参与环化的序列基序和RNA结合蛋白，以及调控启动子活性和同工型变化的因素仍有待确定。
观察结果表明，来自非编码RNA的circRNA比其它circRNA的来源基因座的转录输出所占的比例更高，已经鉴定出新颖的环状反义RNA可能代表了更重要的功能。结果扩大了已知的circRNA起作用的分子机制的范围。
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