时下最火的RNA是谁？那当然非ncRNA莫属了！ ncRNA带着它的freestyle强势来临了！借着这freestyle小编今天就来和您聊聊circRNA那些你不得不知道的事，快跟上我的脚步吧！

Q：我们为什么要关注circular RNA？
A：环状RNA（circRNA）是一类具有闭合环状结构的非编码RNA，其闭环结构可以逃逸RNA酶的降解，因此比线性RNA更稳定。已有的研究表明，circRNA在脑发育神经细胞分化、精神疾病（如阿尔茨海默症）、肿瘤发生与发展中均发挥重要作用。circRNA的研究为非编码RNA的研究开拓了一个新的领域。

Q：如何做环状RNA的序列及功能验证？
A：今天为大家推荐几种circRNA的功能验证策略，主要包括：circRNA定量验证（qPCR法）、Northern blot验证、过表达（正向验证）、基因沉默（反向验证）。

1circRNA定量验证（qPCR法）
常规的线性mRNA在qRT-PCR验证是采用前后设计探针的方式，而circular RNA验证时则采用和线性mRNA分子引物方向相反的方式（Divergent PCR），以证明circRNA确实是存在和差异表达。

qPCR线性RNA和环状RNA设计原理及扩增产物图

circRNA引物设计相比线性RNA比较麻烦。因此，很多人苦于对调取circRNA全长及验证circRNA的成环性。今天向大家分享circRNA调取全长序列及引物的设计方法，希望能帮助各位顺利开展circRNA的研究。

circRNA全长调取及引物设计方法
1）在研究circ RNA时，我们主要利用cirbase数据库。
通过cirbase数据库(http://www.circbase.org/)获得circRNA的序列，例如hsa_circ_0014629：

2）将网页中的 circ sequence 选项更改为“spliced”，再点击 “search”，即可下载circRNA的全长序列信息：

3）点击fasta下载序列，可以得到下图的序列：

4）针对上述序列，即可设计circRNA的全长序列调取引物，设计方法与常规基因引物设计完全一致。取首尾各150bp进行拼接，末尾150bp作为拼接后的首序列，如下：

5）将该部分300bp用primer-blast进行引物设计，具体参数如下：

6）选择引物对。注：PCR产物包含back-splicing位点

2Northern blot验证circRNA序列
在Northern blot方法验证RNA序列时需要注意的是探针的设计是事关杂交实验成败的关键因素，对于exon环化circRNA，设计的探针要求跨越back splice junction位点；对于含内含子环化circRNA，除了跨back splice junction位点设计探针外，还可在内含子区域设计探针。

验证步骤：
A. 对total RNA去DNA、去rRNA、去线性RNA（RNAseR/H消化）处理，与探针杂交；
B. Total RNA与探针杂交；
C. 基因组DNA与探针杂交。
以上A、B、C同时进行，共同验证。

3过表达——正向验证
circRNA过表达的原理主要是基于circRNA的成环机理。形成circRNA的外显子侧翼序列含有互补的Alu元件。基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列（注意扩增的模板就是DNA），随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接载体，转染进对应细胞样本。设计引物扩增产物后进行片段回收，通过sanger测序验证转染效率，或构建共表达载体（带GFP标签）通过荧光判断转染效率，最后利用divergent primer验证circRNA过表达情况。

过表达建议：扩增包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列的目标区域。有研究表明侧翼上下游1kb处过表达效果更明显。

4基因沉默——反向验证
通过siRNA干扰封闭circRNA的功能。针对外显子环化circRNA，可在back splice junction位点前后设计siRNA；针对内含子环化circRNA，除了back splice junction位点前后序列设计siRNA以外，也可针对内含子序列设计siRNA；每个siRNA设计对应对照，对照siRNA设计要求：back splice junction位点一端互补配对，另一端错配（阴性对照）。

siRNA沉默circRNA功能

通过小编今天的介绍，大家是不是对circRNA定量引物的设计以及功能验证有了更深的了解呢，希望可以为各位科研大大的研究助上一臂之力！
参考文献
[1] Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2015, 22(3):256.
[2] Rybak-Wolf A, Stottmeister C, Glažar P, et al. Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed[J]. Molecular Cell, 2015, 58(5):870-85.
[3] Conn, Simon , Pillman, et al. The RNA Binding Protein Quaking Regulates Formation of circRNAs.[J]. Cell, 2015, 160(6):1125-34.
[4] Jeck W R, Sharpless N E. Detecting and characterizing circular RNAs.[J]. Nature Biotechnology, 2014, 32(5):453-61.

来源：诺禾致源