环状RNA TTBK2通过作用miRNA-217影响相应的靶基因HNF1β和Derlin-1从而调控脑胶质瘤的发展

 

TTBK2 circular RNA promotes glioma malignancy by regulating miR-217/HNF1β/Derlin-1 pathway

脑神经胶质癌是最常见和高致死的脑部肿瘤，主要类型有管膜瘤，髓母细胞瘤，星形细胞瘤等，其中星形细胞瘤是最常见的。电影《吃吃的爱》中小S扮演的角色之一就是死于脑神经胶质瘤。Circular RNAs (circRNAs)是非编码RNA中的一种，具有调控miRNA、mRNA参与相关转录调控。而TTBK2（Tau tubulin kinase 2）是一种能磷酸化tau和tubulin的激酶，在很多疾病中表达异常，例如在肌肉侧索硬化病中就异常表达。作者在预实验中发现circ-TTBK2在胶质瘤组织中高表达，所以猜测circ-TTBK2能促进胶质瘤的发展。

研究circ-TTBK2对神经胶质瘤恶化的调控机制。

1、是circ-TTBK2在神经胶质瘤组织和细胞系中表达上调而不是线性TTBK2，circ-TTBK2在胶质瘤细胞系有促癌作用。
通过荧光原位杂交（FISH）和实时荧光定量PCR（q-PCR）比较circ-TTBK2在正常脑组织（NBTs）和I期～IV期胶质瘤组织含量。发现与NBTs组相比circ-TTBK2在胶质瘤组织中表达明显更高，而且随着肿瘤的分级的恶化表达量逐级上升。同时也检测了circ-TTBK2胶质瘤细胞系（U87和U251）表达比在正常星形胶质细内的显著上升。而线性TTBK2无论在胶质瘤组织还是在胶质瘤细胞系中表达都没有上升。过表达circ-TTBK2可以促进胶质瘤细胞系的增殖、迁移、入侵能力，同时抑制细胞凋亡。验证了circ-TTBK2在胶质瘤细胞中的促癌作用。

2、miR-217在胶质瘤组织和细胞系中表达下调，能够抑制胶质瘤细胞的发展。

通过FIS和q-PCR检测到miR-217在肿瘤组织和细胞系中表达显著下降，而且过表达miR-217能显著降低肿瘤细胞U87和U215的增殖、迁移、入侵能力，促进细胞凋亡。

3、miR-217是circ-TTBK2的作用底物而不是线性TTBK2的作用底物，miR-217的过表达能逆转circ-TTBK2的促癌作用。

通过生物信息学数据(Starbase)分析发现circ-TTBK2存在miR-217的结合位点，通过双荧光报告基因检测发现circ-TTBK2和miR-217存在相互作用，而circ-TTBK2结合位点突变后与miR-217不存在相互作用。同时也通过RIP（RNA-蛋白免疫沉淀）实验证明了circ-TTBK2降低miR-217的表达量是通过参与形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。当miR-217过表达且circ-TTBK2沉默时的胶质瘤细胞增殖、迁移、入侵能力显著下降，细胞凋亡明显上升；而当circ-TTBK2过表达且miR-217沉默时与上面的结果又是相反的。这些实验证明了circ-TTBK2和miR-217是通过负反馈调节调控胶质瘤的恶化发展。

4、HNF1β是miR-217的作用底物，而且与circ-TTBK2和miR-217一起参与调控胶质瘤细胞的发展。

利用生物信息学数据库 (TargetScan, miRanda,和 RNAhybrid)分析发现HNF1-β是miR-217的作用底物，通过双荧光报告基因检测也验证了HNF1β与miR-217存在相互作用。免疫组化和Western blot验证HNF1-β在胶质瘤组织和胶质瘤细胞内高表达，而且在晚期胶质瘤组织中的表达量高于早期胶质瘤。单独或是同时调控胶质瘤细胞circ-TTBK2和miR-217的表达量， HNF1-β的表达也会随之改变。circ-TTBK2过表达HNF1β的表达量会随之上升，相反miR-217过表达HNF1β的表达量会随之下降。说明circ-TTBK2和miR-217一起参与调控细胞内HNF1-β的表达量。HNF1β在胶质瘤细胞内过表达能促进细胞的增殖、迁移、入侵，抑制细胞的凋亡。

5、HNF1-β能与Derlin-1的启动子结合，调节Derlin-1在胶质瘤细胞内的表达，同时Derlin-1也是胶质瘤细胞的促癌基因。

利用DBTSS HOME database分析HNF1-β能与Derlin-1的启动子结合，通过CHIP（染色体免疫沉淀）证明HNF1-β能直接与Derlin-1相互作用。HNF1-β过表达能使胶质瘤细胞内的Derlin-1表达显著上升。Derlin-1和HNF1-β一样在胶质瘤组织和胶质瘤细胞内高表达，而且在晚期胶质瘤组织中的表达量高于早期胶质瘤；Derlin-1过表达在胶质瘤细胞内过表达能促进细胞的增殖、迁移、入侵，抑制细胞的凋亡。

6、miR-217可与HNF1-β一起参与调控胶质瘤细胞的发展和Derlin-1参与PI3K/AKT 和 ERK 的信号通路。

过表达miR-217 同时沉默HNF1-β时能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、入侵，促进细胞凋亡。同时也能降低胶质瘤细胞内Derlin-1参与 PI3K/AKT 和 ERK 的信号通路相关蛋白的表达。这些结果提示miR-217的过表达可抑制胶质瘤恶化，而且是通过PI3K/AKT 和 ERK 的信号。

7、在动物水平验证circ-TTBK2和miR-217共同调节胶质瘤的发展。

通过异种移植发现，小鼠同时接种过表达miR-217和沉默circ-TTBK2的人胶质瘤细胞后肿瘤的大小以及体积最小，生存率最高。

结论：在胶质瘤中可能存在下面的关于circ-TTBK2的调节通路来促进胶质瘤的恶化。

circ-TTBK2通过海绵作用吸收miR-217通过RISC途径降解miR-217，没有miR-217与HNF1β的3’UTR结合抑制HNF1β表达，过表达的HNF1β可转入核内与Derlin-1的启动子结合促进Derlin-1的表达，进而调控PI3K/AKT 和 ERK 的信号通路，最终促进胶质瘤的恶化。

肿瘤疾病中环状RNA研究的思路

1. 一个故事最少需要2个成员，要找到circRNA的作用底物，可以是miRNA,也可直接是目的基因蛋白。而比较完美的故事是有circRNA，有miRNA和目的靶基因。寻找方法一般通过高量测序寻找在正常和肿瘤组织中有差异表达的circRNA和miRNA,在通过一些数据库寻找与这些差异RNA有联系的目的基因。

2. 通过FISH、qPCR等技术确定circRNA、miRNA以及目的基因在肿瘤组织、细胞中的表达量。

3. 研究circRNA对miRNA的影响，过表达或是敲除circRNA检测肿瘤细胞系中miRNA的表达量，以及肿瘤细胞的增殖、迁移、入侵和细胞凋亡的改变。也可通过异体移植实验来增加效果。

4. 研究circRNA与miRNA以及miRNA和目的基因是否有相互作用或是结合，可参考文中的双荧光报告基因检测，也可利用RIP。

5. circRNA最后作用目的基因最好能和某个信号通路联系起来，可以更好解释circRNA是怎样调节肿瘤的发展。

参考文献：Zheng J et al. J Hematol Oncol. TTBK2 circular RNA promotes glioma malignancy by regulating miR-217/HNF1β/Derlin-1 pathway. 2017 Feb 20;10(1):52.

（删改）来源：永诺生物