具翻译功能的 Circ-ZNF609及其在肌生成中的功能研究

Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis

circRNA以独特的结构参与转录，但其功能仍有待研究。目前circRNA通过反剪接反应的生物合成方式已被广泛认同，然而他们在生理相关过程的调节作用仍未阐明。本文研究circRNA在小鼠和人类成肌细胞的体外分化过程中的表达差异，发现高保守circRNA的表达水平受肌生成和杜氏营养及不良症（DMD）状态的影响。采用高通量功能基因筛选来研究肌分化中circRNA的功能，发现Circ-ZNF609能特异性地调节成肌细胞的增殖。令人意外的是，与线性转录子一样，Circ-ZNF609包含了一个从起始位点到终止位点的开放阅读框架（ORF）。除此，Circ-ZNF609能与高密度多核糖体结合，且能以剪切依赖和帽子不依赖的方式翻译蛋白。这为真核细胞circRNA能编码蛋白提供了一个有利的证据。

环状RNA是一种非编码RNA，其通过反剪接产生，以共价键形成闭合环，不具有5’帽子和3’尾巴结构。它可以作为miRNA海绵调控靶基因的表达，也可以与多种蛋白结合发挥不同的生物学功能。尽管环状RNA已在多种细胞组织中被研究，但其对生物代谢过程的调控作用仍有待研究。
目的

研究肌生成相关的circRNA及其在肌生成和肌肉疾病中的作用。

1、肌细胞内circRNA表达丰富，进化高保守

通过RNA-Seq筛选人源和小鼠（C2C12）成肌细胞（GM, myoblasts）分化为肌管细胞（DM, myotubes）过程以及杜氏肌营养不良症状态下差异表达的circRNA，并采用FindCirc软件检测circRNA(图1A)。检测到人和小鼠的GM和DM中均存在丰富的circRNA（图1B）。对这些circRNA进行基因组区域（GO）注释，发现近90%的circRNA源自编码蛋白基因的外显子区(图1C)。此外，研究人员发现有相当一部分的circRNA（特别是高表达的circRNA）在人类和小鼠之间具有较高的保守性(图1B, 1D)。

2、肌肉分化和疾病对circRNA表达的影响

本文研究circRNA表达差异，仅将来源于人类样本、至少含有5个反剪接反应(back-splicing) reads的circRNA纳入研究。图2A表明GM和DM各自的两个重复样本间的circRNA具有非常好的相关性，说明两个重复之间具有高度的一致性。从整体上观察肌肉分化及疾病状态下circRNA表达谱差异（图2B），结果展现了两种差异：第一，人源GM和DM之间circRNA的表达存在较大差异，说明肌分化能调节circRNA的表达；第二，相比正常人，肌营养不良症病人的GM与DM中均存在着大量异常表达的circRNA，说明疾病状态也影响circRNA的表达（图2B）。circRNA与linear RNA比率的结果已与上述结果一致（图2C,2D）。进一步探究差异表达的circRNA与linear RNA的关系，发现circRNA和linear RNA之间的表达呈现正相关关系（图2E）。此外，circRNA的丰度显著高于无差异和下调组，即上调基因的差异比较显著（图2F）。

3、 基于RNA干扰技术的circRNA功能筛选

根据circRNA的保守性、表达丰度、调控分化作用和环化率4个指标，研究在肌分化过程中具有重要作用的circRNA，筛选到31个候选circRNAs。在RT-PCR和RNase R抗性实验确证后，研究人员对20个circRNAs进行了45个siRNAs干扰。进一步的溴脱氧尿苷（BrdU）标记实验（图4A）显示，敲低circ-ZNF609明显抑制了细胞的增殖（约80%），提示其在成肌细胞增殖过程中可能起着重要调控作用。随后发现敲低circ-ZNF609亦能抑制增殖标志物CDK1和cyclin A2的蛋白表达（图4E）。此外，在DMD病人的成肌细胞中circ-ZNF609的表达明显升高（图4G）。以上结果表明，circ-ZNF609可通过调控细胞增殖影响肌生成。

4、Circ-ZNF609能编码蛋白

深入研究后发现，Circ-ZNF609是由ZNF609基因的第二个外显子开始环化形成。令人意想不到的是，Circ-ZNF609竟含有一个753-nt的开放阅读框（ORF），其中包含转录起始位点和终止密码子(图5A)。另外，通过蔗糖梯度分离实验发现Circ-ZNF609与高密度的多核糖体存在结合(图5B)，这意味着circ-ZNF609可能编码蛋白质。为确证circ-ZNF609是否具有编码蛋白质的能力，研究人员对能特异性过表达Circ-ZNF609的p-circ载体进行结构改造，利用CRISPR/Cas9技术在p-circ基础上添加3×Flag标签，构建了p-circ 3xF载体(图6A)。利用过表达和突变实验，验证了Circ-ZNF609的结构中关键位点（两个起始位点）对于编码蛋白的作用。此外，热应激（2h 44℃）能使circ-ZNF609的翻译能力增强（图6F）。以上实验表明，CircZNF609能翻译蛋白，且该过程受热应激诱导。

5、IRES激活Circ-ZNF609的UTR（非编码区）

由于circRNA没有帽子结构（cap），其翻译需要一个IRES序列（内部核糖体进入位点）。为检测Circ-ZNF609是否具有IRES活性，研究人员将其UTR插入双顺反子结构的萤火虫和海肾萤光素酶之间，构建荧光报告酶基因(6G)。结果显示，内源性Circ-ZNF609的UTR具有依赖于剪接方式的IRES活性(6H)，即Circ-ZNF609能在IRES的驱动下以剪切依赖的方式翻译蛋白质。

经验总结

该研究的初始目的是寻找肌生成特异相关的circRNA，通过前期的高通量筛选、利用siRNA技术进行的功能性筛选发现了具有翻译功能的Circ-ZNF609，后期实验则是对其翻译功能的验证和机制探索。该研究不仅找到多种与肌生成特异相关的circRNAs，更重要的是发现了能够翻译蛋白质的Circ-ZNF609。我们从中得到启示：大的发现往往是在不经意时被挖掘的，但其前提是要不懈努力、不断地研究探索。

Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22.

文：永诺生物