CircRNA引物设计

与常规PCR引物设计不同，circRNA引物设计应满足以下原则：

1、对于外显子环化circRNA，引物跨剪切位点（backsplice）设计；

2、对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点设计，也可围绕内含子区域设计引物；

3、扩增产物长度建议不超过100 bp。

一、序列位置变换

由于已获取的序列为环序列从剪接位点（backsplice）处打开后的线性序列，因此，为复原序列成环时的位置关系，应先进行序列位置变换后再进行引物设计（设计原理如下图）。

二、截取3’端50-100 bp长度序列置于5’端头部，形成一个新的序列。以hsa_circ_0063162为例，具体步骤如下：

hg19_hub_1_salzman_circRNAsrange=chr22:36889680-36889850

5′ CTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTGTTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTT 3’

三、将3’端蓝色序列移至序列5’端头部，位置变换后的新序列如下：

5′ TTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTTCTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTG 3′

四、新的序列中蓝色字体与黑色字体碱基相连处即为circRNA剪接位点处，引物设计按照常规PCR引物设计原理，跨剪接位点上下游进行设计，最终扩增产物必须包含剪接位点。

五、Primer 5引物设计步骤

打开 primer 5.0 软件，点击“File”/New/DNA sequence，如下图所示：

六、复制粘贴新的circRNA序列至软件中，如下图：

七、点击  primer按钮进行引物设计，如下图：

八、点击 search按钮，程序会自动设计引物，系统弹出下图对话框。请在以下对话框中修改参数，包括正反向引物结合模版起始终止位点以及PCR产物。

以hsa_circ_0063162为例，剪接位点处于77-86之间，sense primer：1-50；Anti-senseprimer：100-171；PCR Product：20-100 bp。

九、引物筛选

填写以上参数后，点击OK按钮，程序会弹出引物Search结果，如下图所示，共有6对引物符合要求。

点击OK按钮，程序会弹出可选引物对的评分，如下图所示：

十、引物评估

对软件给出的引物根据系统评分从高到低进行筛选。以hsa_circ_0063162为例，选取评分最高的引物进行评估，如下图所示：

十一、引物调整

使“Sense”中的“Tm”与“Anti-Sense”中的“Tm”差值的绝对值不大于2.5，“GC%”=40%~70%；核对“Hairpin”，“Dimer”，“False Priming”，“Cross Dimer”，调整后结果如下图所示：

16.引物输出

点击“Edit”/“Copy”，输出“Sense primer”及“Anti-sense primer”，引物序列信息如下：

Senseprimer ：5′  TGTGATGGATGGCCGTGG  3’；

Anti-senseprimer：5′  AACTGTTTGGACACCGATTTGC  3′

进一步地，可再对获取的引物进行特异性评估，将引物序列导入NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中，采用“Primer-Blast”工具进行引物特异性比对分析。