转载自：南京集思慧远生物科技有限公司|Lei

摘要

目前关于circRNAs在马铃薯胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense，pcb）中交互作用的研究资料较少。本研究对马铃薯品种Valor(感病)和BP1（抗病）受Pcb感染的时间序列样品进行了circRNA的系统鉴定。共检测到2098个circRNA，约有一半(931，44.38%)是基因间区circRNA。差异表达分析检测到429个明显调控的circRNA，circRNA通过调节亲本基因和对miRNA的海绵作用来参与调节。亲本基因和miRNA靶向mRNA的GO富集揭示这些差异表达的circRNA参与了防御反应(GO:0006952)、细胞壁(GO：0005199)、ADP结合(GO：0043531)、磷酸化(GO：0016310)和激酶活性(GO：0016301)，揭示了circRNA在调节马铃薯免疫应答中的作用。此外，加权基因共表达网络分析(WGCNA)发现，circRNA与编码基因和lncRNA密切相关。它们共同被专一调控，以增强马铃薯对pcb感染的免疫反应，这意味着circRNA在重编程疾病应答转录组中的作用。文章的研究结果将为马铃薯--pcb相互作用提供新的见解，并可能引领未来新的疾病控制策略。

前言

先前的研究已经表明，lncRNA在响应Pcb感染马铃薯基因表达中起关键作用。然而，据我们所知，circRNA在马铃薯-Pcb相互作用中的作用目前尚不明确。在本研究中关注：（1）马铃薯感染Pcb后circRNA的鉴定和特性描述;（2）通过亲本基因和miRNA靶向mRNA的GO富集分析，差异表达circRNA参与了哪些通路，以揭示其在调节马铃薯免疫应答中的可能作用;（3）通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）推断编码基因，circRNA和lncRNA之间可能的调控网络。

西瓜材料与方法

马铃薯两个品种的茎组织：Valor，感病型；BP1，抗病型；

五个时间点：CK，6hpi，12hpi，24hpi和72hpi，每个时间点三次重复；（hpi：被Pcb侵染后X小时）

从NCBI（GSE74871）下载RNA-seq的Raw reads和lncRNA的Raw counts；

Trimmomatic（v0.36）：数据质控除低质量读数；

TopHat2（v2.0.13）：将clean reads与马铃薯基因组比对；

Cuffdiff（v2.2.1）和DESeq2（v1.16.1）：差异基因鉴定；

Blast2go：GO注释和GO富集分析；

DESeq2：对lncRNA的Raw counts进行归一化；

CIRI2 (v2.0.5)：扫描序列比对/图谱（SAM）比对文件鉴定circRNA。

西瓜研究结果

马铃薯环状RNA全基因组鉴定

最终检测到2098个circRNA，所述样品由至少两个独特的反向剪接，其中1404个品种为Valor，1337个品种为BP1。在这些鉴定的circRNA中，761在Valor中特异性表达，694个在BP1中分别表达，表明circRNA是品种特异性的（图1A，B）。

图1：马铃薯环状RNA（circRNA）的表征。（A）circRNA的数量及其支持的后突读数。（B）两个栽培品种中circRNA的分布。（C）CircRNA基因组起源。（D）每条染色体中circRNA的分布。（E）不同长度范围的circRNA的分布。（F）替代循环事件摘要

马铃薯中环状RNA丰富度的特征

在2098个已鉴定的circRNAs中，约一半（931，44.38％）为基因间circRNAs，776（36.99％）是外显子circRNAs，200（9.53％）为lncRNA衍生circRNAs，其余191（9.10％）为内含子circRNAs（图1C）。关于染色体分布，染色体9产生大多数circRNA，接着是染色体1和4（图1D）。长度计数分析显示大多数外显子circRNA短于2000个核苷酸（nt），而大多数基因间和lncRNA衍生的circRNA长于2000nt（图1E）。

CircRNA对Pcb感染反应的差异表达

图2：CircRNA对Pcb感染反应的差异表达（A）circRNA相对丰度小提琴图。（B）差异表达的circRNA数目。

在感病品种Valor中，CircRNA被Pcb侵染后显着下调，在抗病品种BP1中，被Pcb侵染后显着上调，表明它们在两个品种中具有不同的调节模式，并且可能在免疫应答中发挥潜在作用（图2A）。在2098个circRNA中，429个circRNA在响应Pcb感染时具有显着的差异表达水平，抗病BP1中有275个，感病Valor中有287个，二者之间有428个（图2B）。

CircRNA作为亲本基因的调节因子

图3：差异表达circRNA的GO富集分析。（A）由亲本基因丰富；（B）由miRNA靶向mRNA富集。

CircRNA起到了miRNA海绵作用

在本研究中，138个circRNA（在470个差异表达circRNA中）含有miRNA结合位点，表明这些circRNA可能在马铃薯中起miRNA海绵的作用。与在circRNA的亲本基因中的GO分析结果相似，防御反应，磷酸化，ADP结合，和激酶活性，被特异性富集（图3B）。

图S1. 马铃薯circRNA对miRNA家族的海绵作用

在这项研究中，stu-miRNA5303被151个circRNA吸收（图S1）。因此，我们推测在马铃薯免疫应答过程中，151个circRNA通过对stu-miRNA5303家族成员的海绵作用，调节stu-miRNA5303的靶基因。

mRNA-CircRNA-LncRNA共表达网络

已经证明WGCNA可以鉴定与植物中复杂表型和生物过程相关的重要基因。它可以根据基因表达的相似性来识别高表达的基因簇。为了揭示circRNA的潜在功能，对8928个差异表达基因进行了共表达网络分析。总共鉴定到了包含6858个差异基因的26个模块（5466个编码基因，299个lncRNA和1087个circRNA），对应于38至1111个高度共表达的个体。这些模块可以根据其表达模式分为三种类型（图4）。

图4：在两个品种的感染阶段，模块内的蛋白质编码基因，circRNA和lncRNA的表达变化（虚线，Valor;实线，BP1）。不同的背景色代表按表达模式划分的不同模块类型。

在I型模块中聚类的基因被表征为在任一品种中突然下调。在模块1,2和3中，基因在感病中下调，但在抗病中没有明显的下调趋势。

在14个II型模块中聚类的基因被表征为仅在一个品种BP1或Valor中上调。显示快速转录组重编程对于宿主对病原体感染的免疫应答至关重要。

聚类在III型模块中的基因显示出无序的表达模式。然而，在模块22中聚类的基因在每个感染阶段在BP1中显示出比在Valor中更高的表达水平。

图S2 以circRNA为中心的子网络

对已鉴定的circRNA进行验证

对14个随机选择的circRNA进行逆转录RT-PCR和Sanger测序实验。在14个circRNAs中，成功确认了13个（92.86%），表明我们的circRNA鉴定结果可靠性。

图5：通过RT-PCR和Sanger测序验证circRNA。（A）代表性实例chr06：48298033-48291303和（B）图中显示了13种其他circRNA，成功验证。绿色箭头表示发散引物的PCR扩增方向。

结论和观点

①在本研究中，通过表达模式分析和基因功能注释，推测circRNA可能通过调节亲本基因以及充当竞争性内源RNA的角色来参与调节马铃薯免疫应答。

②GO富集显示circRNA参与防御反应，磷酸化，ADP结合和激酶活性。

③此外，基因共表达网络分析发现circRNA与mRNA和lncRNA密切相关，并且它们一起被专门调控以增强马铃薯对Pcb侵染的免疫应答，揭示了circRNA在重编程疾病响应转录组中的作用。

本研究报道的结果为进一步研究circRNA在马铃薯免疫应答中的作用奠定了基础。