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环状RNAVMA21通过靶向miR-200c和X相关的细胞凋亡抑制蛋白保护椎间盘退变。

随着第二代测序技术的发展，small RNA(包括miRNA，ncRNA，siRNA，，piRNA, tRFRNA)在疾病中的研究如雨后春笋般展开，环状RNA相比于线性化的RNA而言circRNA表现出了非同一般的稳定性，circRNA较多的作为miRNA的海绵体（sponge）而存在，且在疾病的发生发展中发挥重要的作用。如何研究在这样的形势下保持严谨与不落俗套，建立好的疾病模型与选择好的实验思路尤为重要。

2018年5月，上海第九人民医院矫形外科的研究人员在Ann Rheum Dis (IF=12.35)上发表了一篇名为 “Circular RNAVMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targetingmiR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein”的文章。为我们在疾病模型中研究circRNA提供了很好的思路借鉴。本文的实验设计思路如下： miRNA差异表达→预测靶基因 mRNA→由ceRNA机制引出 circRNA→细胞模型&大鼠模型证明→疾病IVDD

机制图

结果

1. miR-200c在退行性髓核组织（NP）中上调，参与调节髓核细胞的生存能力和功能

利用数据库GSE45856获得的微阵列数据，对退行性的髓核组织中miRNA的差异表达进行了研究。miRNA芯片检测到的2672个miRNA中，有14个miRNA在退行性髓核组织中上调(图1A)。选择这些候选miRNA， qRT-PCR分析验证。miR-200c、miR-130b-5p和mir -2355 -5p在退行性NP组织中显著上调，其中miR-200c的上调水平最高(图1B)。这些miRNA在腰椎间盘退变（IVDD）大鼠模型中的表达模式与患者样本一致(图1C)。Northern blot也证实了退行性NP组织中miR-200c水平的升高(图1D)。miR -200c过表达细胞(图1E)显示凋亡细胞百分比增加(图1F)， caspase活化升高，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5表达增加，胶原蛋白II和aggrecan表达减少(图1G)。这些结果提示miR-200c在髓核细胞中的促凋亡和促代谢效应。值得注意的是作者选择了NP细胞（髓核细胞），一种在腰间盘最丰富的细胞类型，而且分泌多种细胞外基质+细胞因子，调控腰间盘的微环境。

2. miR-200c通过抑制其靶点XIAP调控NPC的生存能力和功能

生物信息学预测凋亡通路调控因子XIAP是miR-200c的潜在靶点(图2A)。退行性NP组织中上调的miRNA与凋亡信号通路调控的相关性。野生型XIAP报告基因的荧光素酶信号被miR-200c抑制，而引入突变则消除了miR-200c的抑制作用(图2B)。与对照组相比，退行性NP组织中XIAP表达减少(图2C)。miR-200c的升高降低了XIAP的表达，而内源性miR-200c的降低增加了NPC中XIAP的表达(图2D)。TNF-αXIAP和IL-1β治疗诱导了在髓核细胞的XIAP蛋白质的减少,而mir – 200 c拮抗剂消除了这种减弱作用(图2 E)。我们进一步研究了miR-200c和XIAP在npc中的功能是否相关。此外,接受TNF-α和IL-1β治疗时，XIAP的缺失明显中和了mir – 200 c拮抗剂在髓核细胞中的拮抗剂作用(图2 F,G),表明mir- 200 c通过XIAP发挥其功能。

3. CCircVMA21充当了miR-200c的海绵

starBase预测miR-200c具有多个环状RNA的结合位点。我们根据前20名的预测环状RNA评分进行筛选。通过qRT-PCR分析，circVMA21在NP组织中得到验证(图3A)。退行性NP组织中CircVMA21水平明显降低(图3B)。 FISH也证实了这一结果(图3C)。使用RNAhybrid对circVMA21与miR-200c的序列进行了比较，发现circVMA21含有6个miR-200c的假定靶点(图3D,)。其中5个位点通过荧光素酶检测得到验证(图3E)。相对于mRNA(图3F)，该环状RNA丰富且耐RNAseR处理。North blot分析显示线性VMA21是通过线性探针检测的，而不是在剪接位点的圆形探针检测(图3G)。pull down试验显示，与引入破坏miR-200c与circVMA21结合位点的miR-200c突变相比，miR-200c富集了circVMA21(图3H)。CircVMA21来源于VMA21基因的最后一个外显子，主要转录mRNA的3’UTR。我们发现它拥有69个AGO2蛋白结合位点。交联和免疫沉淀(CLIP)序列显示至少30个AGO2结合区域位于VMA21 mRNA的3’UTR。其中5个区域与miR-200c的结合位点重叠(图3I)。AGO2免疫共沉淀发现内源性AGO2下调的circVMA21在转染miR-200c的NPCs中富集，但未富集其突变体(图3I)，提示miR-200c促进了AGO2与circVMA21之间的联系。North blot分析显示circVMA21可以反向拉低miR-200c(图3J)。结果表明circVMA21能够直接与髓核细胞中中的miR-200c结合。

4. circVMA21通过靶向miR-200c和XIAP在髓核细胞中发挥作用

腺病毒circVMA21感染导致NPCs中circVMA21过表达，siRNA抑制circVMA21表达(图4A)。North blot分析证实了外源性circVMA21摄入后circVMA21的数量增加(图4B)。circVMA21的上调增加了XIAP的表达，而circVMA21的下调导致了XIAP表达的降低(图4C)。circVMA21上调抑制了miR-200c对XIAP表达(图4D)和活性(图4E)的抑制作用。综上所述，这些结果表明circVMA21作为miR-200c的功能性海绵来调节XIAP的表达和活性。在炎性细胞因子治疗后，qRT-PCR分析发现NPCs中circVMA21水平降低，miR-200c水平升高，均可通过上调circVMA21逆转(图4F,G)。因此，circVMA21的强制表达抑制了这些细胞因子的凋亡和分解代谢作用，促进了胶原蛋白II和aggrecan的表达(图4H)。

5. 在大鼠模型中，椎间盘内注射circVMA21可以缓解IVDD

通过穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(图5A)。在穿刺1周和5周后，腺病毒人circVMA21使用33针细针注射入穿刺的IVD中。在第1、5和9周的x光检查显示，所有IVD穿刺组的椎间盘间隙随时间逐渐缩小。注射后各时间点，circVMA21组与未注射组、circVMA21-mut组椎间盘高度指数百分比(%)无显著差异(图5B、C)。注射9周后，circVMA21组IVDs MRI退变评分明显低于未注射组(图5D、E)。在体内RNA FISH发现circVMA21位于NP区域(图5F)。注射腺病毒circVMA21后，退行性NP组织中的circVMA21水平显著升高，miR-200c水平下降(图5G,H)。腺病毒circVMA21的注射缓解了NP的退行性变化，增强了细胞凋亡和分解代谢反应，降低了IVDD大鼠模型中ECM的组成(图5I,J,K,)。9周时，非注射组的组织学评分明显高于circVMA21组(图5L,M)。综上所述，这些结果揭示了升高的circVMA21水平对抑制鼻咽癌凋亡、抑制ECM分解代谢、促进NP内合成代谢以及在体内缓解IVDD的积极作用