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文章信息：

Deep RNA Sequencing Reveals a Repertoire of Human Fibroblast Circular RNAs Associated with Cellular Responses to Herpes Simplex Virus 1 Infection

发表单位：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所

发表期刊：Cellular Physiology and Biochemistry

影响因子：5.500

技术手段：全转录组测序，小RNA测序

研究背景

环状RNA（circRNA）是一类新的内源性调节RNA，最近被认为是基因表达和病理过程的关键调节因子。它们由pre-mRNAs通过反向剪接形成共价闭环结构。共价闭环结构赋予其对RNA外切核酸酶或RNase R的高抗性。circRNA广泛分布，呈现细胞特异性和组织特异性表达。circRNAs在生理和病理过程中发挥多种调节作用，包括转录调控，选择性剪接，亲本基因翻译调控，细胞周期调控等。尽管已经揭示了circRNA的多种生物学功能，但是关于它们与病毒感染和宿主的抗病毒免疫的关联知之甚少。

单纯疱疹病毒1（HSV-1）是一种人类嗜神经病毒，可引起多种人类疾病，从无症状病毒脱落到致死性脑炎和播散性疾病。HSV-1的初始感染主要发生在上皮细胞或粘膜细胞中，从而导致神经元潜伏感染。在大多数细胞培养物中，HSV-1产生溶解性感染，引发各种细胞应激反应，包括细胞凋亡，抗病毒免疫和DNA损伤反应等，以限制HSV-1感染和增殖。HSV-1已成为研究病毒-宿主相互作用和抗病毒防御的有力模型，越来越多的证据表明，病毒感染可以改变宿主转录组并重塑细胞环境，从而促进病毒的适应性和存活。尽管已经深入研究了HSV-1与其宿主之间相互作用的潜在机制，但是对于HSV-1与其宿主之间的相互作用是否涉及circRNA仍然未知。

研究方法

人肺成纤维细胞系KMB17被HSV-1感染或模拟感染。RNA测序用于分析HSV-1感染后circRNA，基因和miRNA的差异表达。使用RT-qPCR验证差异表达的的circRNA，基因和miRNA。对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析。通过circRNA，基因和miRNA的整合分析来分析失调circRNA的功能，并构建了circRNA-miRNA-基因网络。

取材：感染后48小时，分离来自HSV-1感染和未感染的KMB17细胞的total RNA，分别构建全转录组和小RNA测序文库上机测序，对测序数据进行生物信息学分析。

研究结果

1. 响应HSV-1感染的circRNA

通过分析感染和未感染病毒的细胞发现，HSV-1感染后共有536个circRNA明显失调，其中188个上调，348个下调（图1A），并且差异表达的circRNA存在于各种染色体上（图1B）。此外，实验还检测到丰富的病毒响应性circRNA，如ciRNA1450，circRNA13804，circRNA13855，circRNA13896和circRNA13902，它们在HSV-1感染的细胞中显著失调。通过RT-qPCR验证随机选择的5个circRNA（circRNA3046，circRNA3683，circRNA6783，circRNA7752和circRNA7231）的表达水平，与RNA-seq结果一致（图1C）。

图1 HSV-1感染后失调的circRNAs

2.由HSV-1诱导的失调基因

为了解细胞对HSV-1感染的反应，鉴定了HSV-1感染细胞和模拟感染细胞之间的差异表达基因（DEG）。共检测到3885个差异表达的蛋白质编码基因，包含1377个上调基因和2508个下调基因。大量的DEG被发现与HSV-1诱导的“细胞生长和死亡”和“免疫反应”有关，如RELA，TRAF3，NFKBIA，DHX58，TRIM25，NFKB1，SOCS2和STAT3与“免疫应答”相关，并且在HSV-1感染后显著失调。而TGFB2，CDK1，TP53，CDC25B，PCNA，RBL1，E2F3和CDK6则与“细胞生长和死亡”相关，并且在HSV-1感染后显著失调。随机选择9个基因进行RT-qPCR验证，与RNA-seq结果一致。

图2 HSV-1感染后的失调基因

3.响应HSV-1感染的miRNA

为了研究HSV-1感染对细胞miRNA表达的影响，HSV-1感染和模拟感染细胞中miRNA表达谱比较显示，总共有142种已知miRNA和65种新miRNA显著失调，其中128个上调，79个下调。此外，hsa-miR-7974和hsa-miR-4449的表达水平分别以-5.12倍和6.16倍变化显著改变。为了进一步证实RNA-seq的结果，利用RT-qPCR验证了hsa-miR-146a- 3p, hsa-miR-196a-5p, hsa-miR-4741, hsa-miR-6876-35p, hsa-miR663b和hsa-miR-1247- 5p的表达，与RNA-seq结果一致。

图3 HSV-1感染后失调的miRNAs

4.失调基因的功能富集分析和通路分析

为了深入了解失调基因的功能和HSV-1感染中涉及的生物过程，对失调的基因进行了GO和KEGG分析。GO分析确定了多种丰富的生物学过程，包括“toll样受体信号通路”，“细胞死亡”，“生长调节”，“细胞周期”，“细胞凋亡”和细胞对HSV-1反应相关的“信号转导”途径（图4A），表明病毒感染引起了强烈的细胞反应。此外，KEGG分析表明，失调的基因主要富集在与宿主免疫应答相关的途径中，例如癌症，炎症反应和细胞代谢（图4B）。有趣的是，19个失调的基因（BIRC3，RELA，HSP90B1，NFKBIA等）在NOD样受体信号通路中富集；27个失调的基因（IL24，CLCF1，IL23A，SOCS2等）在JAK-STAT信号传导途径中富集。其他失调的基因在与炎症反应和癌症相关的途径中富集。

图4 GO功能富集和KEGG途径分析失调的基因

5.circRNA-miRNA-基因的整合分析揭示circRNA在病毒-宿主相互作用中的功能

为了研究病毒感染的细胞应答中显著失调circRNA的潜在功能，基于它们的差异表达谱进行了circRNA-miRNA-基因的整合分析。首先，在病毒发病机制中分析了HSV-1诱导的circRNA的调节作用。由于病毒的致病性主要反映在对细胞生长和死亡的影响上，研究分析了circRNA在“细胞生长和死亡”途径中的调节作用，发现几个与“细胞生长和死亡”相关的基因，如CDC6， IRAK3，CREBBP，SKP2，TGFB2和IRAK4可能受HSV-1诱导的circRNA的调节（图5）。并且一个circRNA可能潜在地调节多个基因。如，有17个基因（GADD45G，PRKAR1B，RELA等）可能受circRNA14189的调节。此外，一个基因可能受多个circRNA的潜在调节，如，circRNA14556，circRNA15053和circRNA15655可能调节IRAK3，其由基于circRNA-miRNA-基因调节轴中的miRNA介导。这些数据表明细胞生长和死亡途径可能受到circRNA-miRNA-基因调节轴中HSV-1诱导的circRNA的调节。此外，为了确定HSV-1诱导的circRNA是否调节免疫应答，研究分析了circRNA与免疫相关基因之间的相互作用，如IL11，SOCS2，SPRY1和TRIP6通过circRNA-miRNA-基因调节轴由HSV-1诱导的circRNA调节。这些基因可以在各种免疫应答途径中显著富集，包括RIG-I样受体信号通路，Toll样受体信号通路，JAK-STAT信号通路和细胞溶质DNA感应通路，因此，可以推测HSV -1-诱导的circRNA通过影响免疫相关基因参与细胞抗病毒免疫。

图5 circRNA-miRNA-基因互作网络图（由HSV-1诱导的前10个circRNA及其基因与“细胞生长和死亡”相关的途径构成）

研究意义

本研究通过全转录组测序和小RNA测序分析系统地研究了病毒反应性circRNA及其在HSV-1感染期间的作用。 在HSV-1感染后检测到大量失调的circRNA，基于对circRNA，miRNA和基因的整合分析揭示了它们在对HSV-1感染的细胞应答中的调节作用，表明HSV-1-诱导的circRNA可能通过作为miRNA海绵起作用而调节细胞免疫应答和细胞生长/死亡。本研究结果提供了对circRNA在病毒感染和细胞抗病毒免疫中的功能的新见解，并拓宽了对HSV-1与其宿主细胞之间相互作用机制的理解。

参考文献

Shi JD, t al. (2018) Deep RNA Sequencing Reveals a Repertoire of Human Fibroblast Circular RNAs Associated with Cellular Responses to Herpes Simplex Virus 1 Infection. Cellular Physiology and Biochemistry, DOI: 10.1159/00049147.