原创： 纪照辉 |上海生命基因

circEPSTI1 as a Prognostic Marker and Mediator of Triple-Negative Breast Cancer Progression

circEPSTI1作为三阴性乳腺癌进展的预后标志物和介质

期刊：Theranostics；影响因子：8.537

发表单位：中山大学

circEPSTI1-miR-4753/6809-BCL11A轴通过竞争内源性RNAs（ceRNA）的机制影响三阴性乳腺癌的增殖和凋亡。

我们研究了人类circRNA在三阴性乳腺癌（TNBC）组织中的表达谱，并鉴定了circEPSTI1（hsa_ circRNA_000479）作为显著上调的circRNA。我们进行环状RNA微阵列分析以筛选TNBC的环状RNA表达谱，并进一步研究circEPSTI1。通过敲低三种TNBC细胞系中的circEPSTI1，观察了circEPSTI1对TNBC增殖，克隆形成和凋亡的影响。基于MRE分析和荧光素酶报告基因测定，我们发现circEPSTI1作为miRNA海绵与miR-4753和miR-6809结合，以调节BCL11A表达并影响TNBC增殖和凋亡。高水平的circEPSTI1与TNBC患者的存活率降低相关。

研究背景

三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型，表现出复发增加和存活率降低。大约15％至20％的乳腺癌病例被归类为此亚型。由于缺乏药物分子靶点，与管腔或HER2 +亚型的治疗相比，TNBC治疗非常有限。因此，人们对获得更好的治疗效果非常感兴趣。了解TNBC预后，开发新的预后标志物并鉴定新的抗癌分子靶点。

结 果

1、 鉴定TNBC中的差异环状RNA

我们使用三对TNBC患者样品进行了高通量环状RNA微阵列测定，层次聚类揭示了环状RNA表达模式。在火山中显示了环状RNA表达的变化（图B）和散点图（图C）。结果，173个环状RNA上调，77个下调。差异表达的环状RNA在人染色体上的分布如图D所示。在增加的circRNA中总共注意到150个外显子，8个内含子，12个有义重叠和3个反义circRNA，并且在减少的circRNA中注意到66个外显子，4个内含子，6个有义重叠和1个反义circRNA（图E）。鉴于环状RNA主要来自外显子，大多数差异表达的环状RNA由外显子转录。我们进一步证实了通过qRT-PCR在10个配对的TNBC组织和匹配的正常组织中的四个circRNA的微阵列结果。

2、 TNBC中circEPSTI1环状RNA的表征

circRNA_000479是上调最显著的circRNA。我们假设circRNA_000479来自EPSTI1，其位于染色体13q14上，将circRNA_000479称为“circEPSTI1”，其通过向外引物扩增并通过Sanger测序确认（图F）。我们在一组12个乳腺细胞系中测试了circEPSTI1表达水平，如图A所示，circEPSTI1水平在7种人乳腺癌细胞系中上调，特别是在TNBC细胞系中。此外，通过核和细胞质RNA的qRT-PCR分析评估，circEPSTI1优先定位于细胞质内。RNase R核酸外切酶对消化的抗性进一步证实该RNA种类是圆形的（图I）。

3 、沉默circEPSTI1抑制TNBC生长和增殖并诱导细胞凋亡

我们使用RNA干扰来沉默三种TNBC细胞系中circEPSTI1的表达，观察发现circEPSTI1的下调显著抑制了三种TNBC细胞系的生长。在集落形成测定中，下调circEPSTI1表达，三种TNBC细胞系的集落形成能力显著降低。此外，我们使用EdU分析来评估增殖潜力。随着circEPSTI1表达的下调，TNBC细胞增殖受损。接下来，将细胞转染48小时，通过膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶染色测量细胞凋亡。结果表明circEPSTI1沉默诱导TNBC细胞系中的细胞凋亡。

4 、circEPSTI1作为miR-4753和miR-6809的miRNAs海绵

根据MRE分析，根据circEPSTI1序列中推定的结合位点的位置，前5个miRNA是miR-942，miR-4753，miR-6809，miR-6873和miR-6739。用每种miRNA模拟物和荧光素酶报告基因共转染HEK 293T细胞用于荧光素酶活性测定。响应于miR-4753和miR-6809模拟物，荧光素酶强度降低超过50％。而miRNA模拟物和突变的荧光素酶报告基因的共转染对荧光素酶活性没有显著影响。此外，qRT-PCR分析显示miR-4753和miR-6809没有显著降低circEPSTI1的水平，表明circEPSTI1不被miR-4753和miR-6809消化。这些数据表明circEPSTI1可以作为miR-4753和miR-6809的海绵。

5、 BCL11A是miR-4753和miR-6809的直接靶基因，并通过circEPSTI1敲低被抑制

我们首先使用三种算法预测miR-4753和miR-6809的共靶基因为BCL11A。将荧光素酶报告载体单独或与miR-4753，miR-6809或两者一起转染到HEK 293T中。然后进行qRT-PCR和Western印迹分析以确认荧光素酶测定结果。结果显示miR-4753和miR-6809没有改变mRNA水平，但与阴性对照相比，注意到BCL11A蛋白水平的显著降低。此外，我们发现敲低circEPASTI1也降低了BCL11A蛋白水平。

6 、circEPSTI1-miR-4753/6809-BCL11A轴影响体内TNBC的生长和增殖

我们将用乱序或si-cEPSTI1-1 siRNA处理的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468细胞皮下注射到裸鼠中。在连续肿瘤内注射两周后，结果显示，与三种皮下移植模型中的争夺阴性对照相比，敲低circEPSTI1减少了肿瘤体积和肿瘤重量。此外，免疫组织化学检测各组移植肿瘤组织中BCL11A，caspase-3和Ki67蛋白的表达。BCL11A和Ki67的表达显著降低，而si-cEPSTI1-1组的肿瘤组织中caspase-3表达增加。

7 、circEPSTI1与BCL11A表达呈正相关，可作为TNBC的预后因素

ISH分析显示34.6％（83/240）的肿瘤样品表现出高的circEPSTI1表达水平，而IHC分析显示29.6％的肿瘤样品表现出高的BCL11A表达。增加的circEPSTI1表达与TNBC组织中的BCL11A表达正相关。然后，我们分析circEPSTI1表达与TNBC患者临床病理状态的关系，发现circEPSTI1表达与TNBC的肿瘤大小，浸润淋巴结和TNM分期呈正相关。此外，我们分析了circEPSTI1和BCL11A在临床预后方面的意义，使用患者无病生存（DFS）和总生存（OS）进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示，与具有低circEPSTI1表达的患者相比，具有高circEPSTI1表达的患者表现出DFS和OS的平均月减少。此外，具有高circIFPS1和BCL11A表达的患者与DFS和OS减少显著相关。

讨 论

鉴于生物信息学和高通量测序技术的发展，CircRNA已被越来越多地研究，但许多问题仍未得到解决。除了一些众所周知的circRNA，如CiRS-7和circSRY，大多数circRNA的功能仍然未知。此外，关于circRNA在乳腺癌中的作用知之甚少，特别是在三阴性乳腺癌中。据我们所知，这是关于TNBC中circRNA的表达谱和调节功能的第一份报告。对circRNA的进一步研究和关注将有助于我们更好地了解TNBC的进展，并为TNBC的生物标志物或潜在治疗靶点的鉴定提供新的见解。