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2019年国自然申请标书递交的日子步步逼近，想必大家都在努力完善自己的标书吧。近年来，随着国自然基金在职业晋升中参考比重越来越大，申请热度也越来越来高，选择性资助也越来越看重个人的工作背景，其中拥有一篇的五分文章成了国自然面上的默认标配。

今天就通过一篇5分的circRNA文章，简单介绍这类文章的研究思路，并引出一篇青年项目研究内容的设计。

Circular RNA ZNF609 functions as a competitive endogenous RNA to regulate AKT3 expression by sponging miR-150-5p in Hirschsprung’s disease.

该文的通讯作者是南京医科大学儿童医院唐维兵主任医师。唐主任主要做新生儿的消化道畸形诊治。该研究团队报道了一条在先天性巨肠症中的circRNA-ZNF609，在正常的肠道组织中该环状RNA的表达量要高于患病组织中的丰度。细胞实验发现，下调ZNF609能抑制增殖与迁移。接着通过预测的发现了一些可能与ZNF609结合的miRNAs，其中有一些miRNAs的靶基因是AKT3，最后，通过RIP、荧光素酶报告基因实验证实ZNF609能Sponge miR-150-5p，调控AKT3的表达。

关于环状RNA，我们之前也简单聊过：（文章篇）S5E49：看看国内团队是怎么研究环状RNA的？（文章篇）一石双鸟：一个环状RNA circ-Foxo3，两篇paper（上） 一石双鸟：一个环状RNA circ-Foxo3，两篇paper（下）（点击查看）

接下来，就通过这篇文章阐述一下写国自然青年基金时的一些思路：

1、确定分子

circRNA-ZNF609（hsa-circ-0000615）定位于第15号染色体，全长874个碱基。前期已经报道了，在神经元细胞中，circRNA-ZNF609（hsa-circ-0000615）是高表达的，在中枢神经发育过程中起到很重要的作用。在该报道中，作者认为该分子应该在肠道神经系统发育过程中起到重要的作用。

2、确定表型

circRNA-ZNF609是一条新的环状RNA。那么作者通过预实验发现，在80例先天性巨肠症组织中的表达要低于正常肠道组织中的表达量。这就或许表明circRNA-ZNF609参与了先天性巨肠症的致病过程。

既然circRNA-ZNF609可能参与了致病过程，那么通过细胞实验来确定，circRNA-ZNF609到底能引发细胞的哪些表型变化。

干扰掉circRNA-ZNF609能抑制细胞的增殖与迁移，过表达后则能促进细胞的增殖与迁移。

3、确定功能

先确定该分子的定位，实验证实circRNA-ZNF609主要定位于胞浆，这表明该分子主要参与了转录后调控。

前期已经报道，大多数环状RNA属于内源性非编码RNA，其物种之间有较高的保守性，相对于线性的RNA，circRNA具有很高的稳定性。circRNAs报道有大量的miRNAs结合位点，可以像lncRNA那样作为miRNAs Sponge吸附miRNAs，调控下游靶基因的表达。

这么强大的网站，居然还不会用？（点击查看），讲过StarBase数据库，其中有一个功能是ceRNA预测。通过预测，作者发现其中有一条miR-150-5p评分最高（评分越高，越可能结合）。并且验证了它们之间通过这段序列配对结合。

预实验验证，在先天性巨肠症组织中miR-150-5p是高表达的。

4、寻找靶基因

有了ceRNA机制，理所当然的是找靶基因了。依然是预测，作者通过DIANA、miRanda、PicTar、PITA四个数据库预测，取交集得到了3个基因：AKT3、FOXO4、ELK1。预实验发现，在先天性巨肠症组织中AKT3的mRNA显著降低，而FOXO4、ELK1的mRNA则无明显变化。到这里，我们就可以推测出circRNA-ZNF609通过吸附miR-150-5p，从而上调AKT3的表达。

作者通过双变量相关分析，表明AKT3与circRNA-ZNF609的表达呈正相关，和miR-150-5p的表达呈负相关。通过Rescue实验发现，沉默掉circRNA-ZNF609后，能显著降低细胞中的AKT3的mRNA及蛋白的水平；另外加入miR-150-5p的拮抗剂后，能回复AKT3的mRNA、蛋白的水平。

最后，原本我们应该做一下AKT3对细胞增殖和迁徙的作用，但是这里作者没有做，只是做了miR-150-5p对细胞相关功能的影响。

最后，重点来了：我们从别人的报道中发现了一个非编码RNA（环状或长链非编码RNA）A，在其他一些组织里有报道，那么这个分子有可能在我们的研究中也可能起到作用。那么我们通过预实验在我们所研究的疾病组织检测，发现A的表达相对于正常组织中是高或低表达的；通过细胞实验发现，干扰或过表达A后，细胞具有某种表型变化。而数据库或预实验发现，该分子是主要定位于胞浆中的，那么我们推测A分子可能通过转录后调控机制参与疾病的发生发展。而circRNA、lncRNA均具有sponge miRNAs的功能，通过数据库预测，发现A能吸附一些特定的miRNAs，选择一个打分比较高的miRNA。接着结合数据库继续预测一些能够与该miRNA结合的mRNA。最后，通过预实验验证在疾病中，该mRNA翻译的蛋白表达情况是否跟A分子呈正相关。那么作为ceRNA调控方式的整体框架就有了A-miRNA-mRNA-疾病发生。

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而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：

①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；

②分子拷贝数的表达变化差异；

③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；

④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；

⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；

⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；