原创: 纪照辉 上海生命基因
Synthetic Circular RNA Functions as a miR-21 Sponge to Suppress Gastric Carcinoma Cell Proliferation
合成环状RNA作为miR-21海绵抑制胃癌细胞增殖
期刊:Molecular Therapy-Nucleic Acids;影响因子:5.660
发表单位:西安交通大学
导读
合成circRNA可以作为miR-21海绵抑制胃癌的进展。
摘 要
我们假设合成的circRNA海绵可以实现针对特定miR的治疗性功能丧失。然后经过试验得出,可以使用简单的酶促连接步骤合成对核酸酶消化具有抗性的人工circRNA海绵。这些海绵抑制癌细胞增殖并抑制miR-21对下游蛋白质靶标的活性。总之,合成的circRNA海绵代表了一种简单,有效,方便的策略,用于在体外实现miR功能的靶向丧失,并且在人类患者中具有潜在的未来治疗应用。.
背景介绍
胃癌(GC)仍然是全球第五大常见癌症,也是癌症死亡的第三大原因。大多数GC病例在晚期诊断,结果不良,治疗效果受到很大限制。进行细胞毒性化疗。幸运的是,随着我们对胃分子癌发生的深入理解,目前正在发现基于分子靶向治疗的2种新的潜在治疗策略。
结 果
1 、miR-21在癌症基因组图谱患者中过表达
基于来自癌症基因组图谱(TCGA)中的446个GC和45个正常样品的miR序列数据,鉴定了185个异常表达的miR,其中137个上调,48个下调。miR-21,我们感兴趣的miR,在GC中比正常样品上调1.76倍。
2 、miR-21在胃癌细胞中异常过表达
使用TaqMan qRT-PCR分析,相对于正常胃上皮细胞系HFE145,我们发现miR-21在NCI-N87、KATOIII、AGS、MKN28中显著过表达。我们选择NCI-N87,AGS和MKN28进行后续研究,因为miR-21的表达水平高于KATOIII细胞。
3 、circRNA海绵可以在体外正确合成
我们的体外RNA环化策略使用含有5个重复miR凸起结合位点的合成线性RNA的酶促连接。通过RT-PCR和Sanger测序验证了circRNA海绵的精确构建。RT-PCR结果证实,不同引物仅从环状(scRNA21)模板RNA产生预期的100-nt产物,而不是从相应的线性(LRNA21)模板RNA产生。相反,会聚引物从圆形和线性RNA模板产生预期产物。此外,头部到尾部的circRNA连接点仅在scRNA21产生的不同PCR产物中得到验证。在由LRNA21和scRNA21海绵产生的会聚PCR产物中验证了五个重复的miR-21凸起(错配)结合位点。在阴性对照杂乱的circRNA中也证实了头对尾连接和五个重复的杂乱位点。
4、 与其线性对应RNA相比,circRNA海绵对核酸酶的降解更具抗性
将核酸酶介导的scRNA21海绵降解的抗性与其线性对应物LRNA21的抗性进行比较,首先使用胎牛血清(FBS)介导的降解。30分钟后,LRNA21在4%FBS中降解92%。相反,scRNA21显著更稳定,30分钟后仅降低9%。事实上,scRNA21仅在FBS中以7%或更高的浓度降解。然后在用特异性外切核酸酶RNase R消化后比较环状和线性RNA的稳定性。LRNA21分别用1或3U RNase R/1μgRNA降解94%或97%;相反,scRNA21仅降低9%或14%。
5 、合成circRNA miR海绵的功能效力
在共转染后24小时测定NCI-N87,AGS和MKN28 GC细胞中的标准化萤火虫荧光素酶活性,发现在所有三种细胞系中观察到降低的标准化萤火虫荧光素酶活性。当含有多个miR-21结合位点的荧光素酶报告质粒与常规线性miR-21抑制剂共转染时,萤火虫荧光素酶活性恢复。值得注意的是,当用我们的scRNA21共转染细胞时,观察到甚至更大的荧光素酶活性恢复。这些发现证实了scRNA21作为miR-21海绵的功能有效性。随后通过WST-1测定转染细胞显著降低的细胞增殖与显著增加的细胞凋亡。
6 、合成环状miR海绵的下游蛋白质组学效应
使用Tandem Mass Tag(TMT)标记进行泛蛋白质组学筛选得到6,314个单独蛋白质的列表。根据Ingenuity Pathway Analysis的目标预测,其中的235种代表了miR-21的推定的直接结合靶。235种蛋白中的19种增加了倍数变化。在scRNA21处理后,这些预测的直接miR-21靶标的蛋白质水平(其应被miR-21下调)恢复。在COSMIC共识癌基因列表中发现了这19种死亡域相关肿瘤抑制蛋白DAXX中只有1种。然后使用抗DAXX抗体进行蛋白质印迹。这些实验证实在scRNA转染两种GC细胞系NCI-N87和AGS后8小时恢复DAXX蛋白水平。这些数据证明了scRNA21针对特定miR-21下游靶肿瘤抑制基因的功能活性。
讨 论
在未来的研究中,我们将确认scRNA21对肿瘤生长的影响,研究scRNA21活性的潜在机制,并评估动物模型中的scRNA21毒性。尽管有这些潜在的缺陷,并考虑到oncomiRs在肿瘤发生和肿瘤进展中的关键作用,据我们所知,这些结果首次揭示了合成circRNA海绵作为抗癌研究和未来分子疗法的新工具的巨大前景。
miRNA-21被吸附以后的其他影响还不能确定,但是这个思路挺好的。赞!