原创： 转录调控事业部 |上海派森诺

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫疾病，其特征在于产生针对各种自身抗原的自身抗体。以往的大量研究探讨了其发病机制，包括环境，遗传和激素因素，如紫外线（UVB），维生素D缺乏，病毒，DNA低甲基化microRNAs（miRNAs）的异常表达， 但是对SLE中CircRNA的表达谱和功能研究很少。

CircRNA作为天然miRNA海绵可抑制miRNA的相关活性，在许多疾病的发生和发展中起着重要作用。且闭合环状的CircRNA比miRNA具有更高的稳定性，被认为是比miRNA更好的生物标记。那么CircRNA是否参与了SLE的发病机制，以及CirRNA与SLE中DNA甲基化水平的关系也就很值得去研究和探讨。

接下来与大家分享的是第一项研究SLE患者CD4+ T细胞中circRNA的研究结果。在这篇文章中，作者以circRNA表达谱结果为基础，通过RT-PCR、western blot、小干扰RNA转染、荧光素酶报告基因和FISH等技术手段筛选并确认了SLE中hsa_circ_0012919的生物标志物功能，明确了hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的ceRNA。

▶ CD4+ T细胞中CircRNA表达谱分析筛选潜在的候选生物标志物

表达谱分析在SLE患者组获得了12个上调和2个下调的CircRNA，其中在SLE患者组中上调的3种CircRNA可能是潜在的候选生物标志物，包括hsa_circ_0012919，circ_0006239和hsa_circ_0002227。RT-PCR实验验证了3种CircRNA的表达情况，结果显示在健康对照组与SLE患者之间的差异有统计学意义(图1A-C)。

图1 三种CircRNA的表达情况

▶ 在SLE中的诊断潜力确认hsa_circ_0012919是潜在生物标志物

通过比较健康对照，无活动和活动性SLE患者中三种CircRNA的表达，发现hsa_circ_0012919和hsa_circ_0006239表达在活动性SLE患者中高于无活动的SLE患者和健康对照，而健康对照与无活动SLE之间无显着差异（图1D，E）。在有关节炎，狼疮性肾炎，抗dsDNA（+），抗Sm（+），C3或C4缺乏的SLE患者中hsa_circ_0012919表达更高，泼尼松药物治疗后hsa_circ_0012919表达降低。这进一步确认了SLE中的hsa_circ_0012919可被视为SLE的潜在生物标志物。

▶ hsa_circ_0012919下调对DNMT1，CD11a和CD70表达的影响

在SLE患者的CD4+ T细胞中hsa_circ_0012919和DNMT1的表达之间存在强烈的负相关，与CD70的表达之间呈正相关。hsa_circ_0012919和siRNA-NC特异的小干扰RNA转染SLE患者的CD4+ T细胞，与siRNA-NC组相比，DNMT1的mRNA和蛋白表达在无活性和活性SLE患者中显着增加（图2），相反，与siRNA-NC组相比CD11a和CD70的mRNA和蛋白表达显着降低。

图2 hsa_circ_0012919下调对DNMT1，CD11a和CD70表达的影响

▶ hsa_circ_0012919下调和DNMT1对CD11a和CD70 DNA甲基化的影响

为了确定hsa_circ_0012919是否参与SLE患者的DNA甲基化，分析了两个基因（CD11a和CD70）的DNA甲基化水平与hsa_circ_0012919表达之间的相关性，并在hsa_circ_0012919的表达和CD11a、 CD70的DNA甲基化水平之间观察到强烈的逆相关。另外，小干扰RNA转染实验表明hsa_circ_0012919的下调逆转了SLE的CD4+ T细胞中CD11a和CD70的DNA低甲基化，但这种作用可以通过DNMT1靶向的siRNA逆转。

▶ Hsa_circ_0012919通过miRNA-125a调节KLF13和RANTES

CircRNA的主要作用之一是结合miRNA以调节基因的表达。为了探究hsa_circ_0012919可以隔离哪些miRNA，生物信息学使用了hsa_circ_0012919的网络分析。然后我们利用公共数据库circbases和RNA22V2筛选靶向miRNA，结果显示miR-125a-3p，miR -6829-3p和miR-1237-5p具有与hsa_circ_0012919的结合位点（图3）。荧光素酶筛选试验鉴定了miR-125a-3p。狼疮CD4+ T细胞中的FISH分析进一步证明了hsa_circ_0012919和miR-125a之间的相互作用（图3）。后续发现hsa_circ_0012919和miR-125a在细胞质中共定位，这表明hsa_circ_0012919与miR-125a结合。

图3 hsa_circ_0012919靶向miR-125a

已有研究结果显示miRNA-125a可以调节RNATES，KLF13和miR-125a-3p可作为miRNA-125a的活性片段起作用，因此假设hsa_circ_0012919通过海绵miR-125a-3p调节RNATES和KLF13。首先，实验中发现hsa_circ_0012919与狼疮CD4+ T细胞中RNATES和KLF13的表达呈负相关。然后PCR和Western印迹显示miR-125a-3p降低RNATES和KLF13的表达，并且hsa_circ_0012919逆转并增加表达RNATES和KLF13。为了证明hsa_circ_0012919和miR-125之间的直接关系，进行剂量依赖性方式实验。结果显示RNATES和KLF13表达以剂量依赖性方式受miR-125和hsa_circ_0012919的影响。

参考文献

Zhang C, Wang X, Chen Y, et al. The downregulation of hsa_circ_0012919, sponge for miR-125a-3p, contributes to DNA methylation of CD11a and CD70 in CD4+ T cells of SLE[J]. Clinical Science, 2018: CS20180403