原创： 纪照辉|上海生命基因

Twist1 Regulates Vimentin through Cul2 Circular RNA to Promote EMT in Hepatocellular Carcinoma

Twist1通过环状RNA Cul2 调节波形蛋白，促进肝细胞癌的EMT

期刊：Cancer Res.；影响因子：9.13

发表单位：南开大学

Twist是一种关键的上皮-间质转化（EMT）诱导转录因子，可增加波形蛋白的表达。在这里，我们报道Twist1可以转录激活Cullin2（Cul2）环状RNA的表达，进而吸收靶向波形蛋白的miRNA，以增加EMT中波形蛋白的表达。

背景介绍

上皮-间质转化（EMT）对肿瘤转移至关重要，并且涉及细胞重编程过程，其中上皮细胞显著改变其形状，表现出增加的运动性并获得间充质表型。有证据表明Twist1上调了EMT中波形蛋白的表达，但调控机制尚不清楚，波形蛋白启动子上没有确定的Twist1结合位点。

1、circ-10720在临床HCC组织中的表达与患者的转移和预后相关

通过染色质免疫沉淀（ChIP）进行深度测序（ChIP-seq）发现Twist1直接与Cul2启动子结合。双荧光素酶报告系统来检测到Twist1能够激活Cul2启动子的活性。分析75个HCC组织样品后发现在转移性和非转移性HCC组织中Cul2的表达没有显著差异。在circRNADb上预测了几个circRNA并在转移性和非转移性HCC组织中检查了7种circRNA的表达。发现与非转移性HCC相比，转移性HCC中来源于Cul2基因的circ-10720表达持续且显著增加。circ-10720表达水平随着381个HCC组织中临床分期和病理分级的进展而增加。Kaplan-Meier存活曲线显示，circ-10720表达升高表明HCC患者的存活率较低。（注意：此处为什么选择Cul2基因的circ?单纯的circRNA 要预测其功能是极其困难的，我们可以假设重要基因来源的circRNA同样会有重要的功能。Cul2是多种ECS（ElonginB/C-CUL2/5-SOCS-box蛋白）E3泛素-蛋白连接酶复合物的核心成分，其介导靶蛋白的泛素化。）

2 、由Twist1调节的circ-10720在HCC细胞中表现出致癌作用

Cul2位于染色体10中，并且circ-10720由外显子6至外显子12产生。在Twist1过表达的PLC细胞中circ-10720的表达增加，在Twist1敲低的SMMC-7721细胞中表达降低。设计靶向circ-10720的反向剪接序列的siRNA，使用扫描电子显微镜观察发现在circ-10720过表达的PLC细胞中，细胞伪足增加并且细胞形态转变为间充质表型，而在circ-10720耗尽后SMMC-7721细胞变为上皮样细胞。此外，我们发现circ-10720促进了PLC细胞的增殖，迁移和侵袭，并且circ-10720敲低抑制了细胞迁移和侵袭。总之，Twist1促进了circ-10720表达，并且circ-10720在HCC细胞中起着致癌作用（注意：circ的表达依然受到转录因子的调控，而且与其来源基因所受的转录因子调控或许一致，可以因此寻找上调调控因子）。

3 、Twist1通过增加吸附miRNA的circ-10720来上调波形蛋白的表达

在CircInteractome数据库中进行了背景评分百分位筛选出14种miRNA。使用荧光素酶报告系统发现当相应的靶位点在荧光素酶报告基因中突变时，用miRNA转染对荧光素酶活性没有显著影响，表明circ-10720可以作为这些miRNA的海绵起作用。进行功能丧失测定、Western印迹以及免疫荧光分析检查Twist介导的波形蛋白调节是否通过circRNA发生，结果显示Twist1增强了波形蛋白表达水平，而在Twist1过表达PLC细胞中circ-10720敲低抵消了Twist1对波形蛋白表达的促进作用。此外，circ-10720敲低抵消了由Twist1过表达诱导的增强的细胞增殖，迁移和侵袭。

4 、肝癌PDTX模型瘤内沉默circ-10720阻碍Twist1介导的波形蛋白表达

建立PDTX模型，使用qRT-PCR检测来自HCC患者的肿瘤组织中的Twist1表达水平，分为Twist1-Low和Twist-High组。Twist1-Low组的一半小鼠肿瘤内注射携带circ-10720的慢病毒颗粒，Twist1-High组的一半小鼠肿瘤内注射si-circ-10720。Twist1-Low肿瘤中circ-10720的过度表达增加了肿瘤体积。在Twist1-High肿瘤中敲低circ-10720阻断了Twist1对肿瘤生长的促进作用。高Twist1表达水平显著增加波形蛋白表达水平，但circ-10720敲低抵消了Twist1对波形蛋白表达的促进作用。

5、 circ-10720的沉默抑制了DEN诱导的TetOn-Twist1小鼠HCC模型中Twist1诱导的肿瘤转移

用DEN处理TetOn-Twist1小鼠诱导产生HCC，然后将所有发生HCC的小鼠随机分成两组。一组喂无doxycycline水，第二组喂有doxycycline水(Twis1t组) ，促进Twist1表达（Twist组）。7天后，Twist1组中的一半小鼠通过静脉注射（Twi+si-circ-10720组）用si-circ-10720处理，另一半用siRNA对照处理（Twi+siRNA）。测定小鼠肝脏表面上的肿瘤结节数。结果显示doxycycline处理的小鼠显示出显著增加的肿瘤数量，并且注射si-circ-10720的小鼠显示出抵消结果。在Twi+siRNA ctrl组中，Twist1和波形蛋白在肝肿瘤组织中的表达水平增加，而circ-10720敲低阻断了Twist1对波形蛋白在Twi+si-circ-10720组中的影响。

6、 circ-10720是HCC的生物标志物

使用FISH分析了381个HCC样本的circ-10720表达水平，相关性分析显示circ-10720和波形蛋白的表达水平正相关（r=0.439，P=0.000）。Kaplan-Meier分析显示，在75例HCC患者中，circ-10720/波形蛋白的阳性表达与较短的总体存活率相关。此外，我们发现circ-10720表达水平与HCC病例临床分期或病理分级之间的正相关。高circ-10720组中AFP水平显著高于低circ-10720组。表明circ-10720与预后不良和肿瘤进展相关，并且它可能作为HCC的潜在生物标志物。

我们的数据揭示了Twist1对circ-10720介导的波形蛋白的调节以及在EMT期间circRNA的重要作用。这些发现可能有助于开发基于circRNA的恶性癌症诊断和治疗策略。