转载自： House 生信草堂

导 读

用siRNA方法做circRNA敲除实验中最需要注意的是如何排除siRNA对线性转录本的影响。如果不能排除siRNA仅仅作用于circRNA，我们得到的实验结果往往不足以说明该circRNA的作用。

本文针对circRNA敲除实验中实际遇到的问题，结合发表在《Molecular Cell》上的文章实例，详细解读siRNA设计要点，功能筛选细节等。

首先要说一下本次推文中提到的文章，其实我已经在去年的一篇《circRNA高分文章解读——高通量分析篇（上）》中介绍了其生物信息学分析部分。这篇文章主要研究肌发生过程中circRNA的调控作用，虽然文章的重点是阐述circ-ZNF609的蛋白编码能力，但其在证明siRNA干扰circRNA方面也堪称典范。

下面具体解读。

1、针对circRNA设计siRNA要点

先说说理论基础，很简单，百度就能查到，但要真正去体会。对circRNA设计siRNA主要考虑的因素还是避免干扰到线性宿主基因，文章中明确写出了三条注意事项：

（1）Binding site at the head-to-tail junction；

（2）7-mer seed not present in the linear host gene;

（3）chemical modifications within the seed region.

前两条很好理解，就是避免设计的siRNA与线性转录本发生结合，第三条作者的解释是为了减少类似于miRNA效应的影响，这个小编还有待查文献理解。。。

除了文章中提到的，还有一些经验需要注意：

（1）每个siRNA设计对应的对照，即backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配；

（2）对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA。如图1.

图1：circRNA的siRNA设计规则

2、确定siRNA干扰的效应

根据siRNA的设计规则，文章中为25个circRNA分别设计了siRNA， 其中20个可以设计2个，另外5个只能分别设计得到一个。通过siRNA的敲除效应，作者发现有三个circRNA的敲除影响到肌细胞的分化。那么问题来了，siRNA的导入引起的细胞表型改变真的是由于对应的circRNA被敲除所引起的吗？为了说明这个问题，作者先对其中一个进行研究。

如图2，Circ-QKI拥有2个siRNA, 但只有1号siRNA降低了circRNA的表达。更有趣的是，2号siRNA居然敲掉了线性mRNA,这更让作者怀疑circRNA和线性mRNA到底是谁在起作用。

图2： siRNA对circRNA以及其线性宿主基因的影响

紧接着，作者设计了专门针对该circRNA线性宿主基因的siRNA, 发现干扰掉线性宿主基因同样引起了肌细胞分化的表型差异，如

图3.

图3：circRNA和线性mRNA敲除效果对比

排除不了线性mRNA调控的影响，就不能下结论证明circRNA的功能。作者又在另外的两个中寻找，发现了circ-ZNF609的作用。如图4：1号siRNA能显著地减低circ-ZNF609的表达，2号siRNA不改变任何转录本。为此，作者巧妙地设计了三个siRNA:

si-circ, targeting the circ-ZNF609 head-to-tail junction;

si-ex2, targeting both the circRNA and its linear counterpart;

si-mRNA, targeting only the linear mRNA .

观察它们对circ-ZNF609的表达影响如图4：发现si-mRNA不能干扰circ-ZNF609的表达。

图4：三种siRNA对circ-ZNF609表达的影响

将这三个体系分别导入细胞中观察细胞增殖能力的改变，如图5，发现能敲除circ-ZNF609的siRNA（si-circ和si-ex2）都能降低细胞的增殖能力，但敲除线性mRNA的siRNA却不能改变细胞增殖能力。

图5：分别敲除circ-ZNF609和其线性转录本后对细胞增殖能力的影响

总结：

通过学习《Molecular Cell》的这篇文章，我们看到了如何充分地证明siRNA干扰中，仅仅是由于敲除掉circRNA转录本而引起的表型改变。要排除线性转录本的影响，我们首先需要说明设计的siRNA只会降低circRNA的表达而不影响线性mRNA的表达。其次，还需要针对mRNA设计专门的siRNA进行敲除，需证明敲除掉mRNA后对细胞的生理指标没有影响。只有经过以上两步的筛选才能得到circRNA特有的调控功能的结论