•  背景

RNA在生命进程中发挥着非常重要的作用，我们对RNA最初的认识是中心法则中的mRNA，它负责将DNA包含的信息传递给直接参与调控生命活动的主要承担者—蛋白质。然而在RNA世界中，大部分是非编码RNA，包括LncRNA，rRNA, tRNA, snRNA和microRNA，它们在调控生命进程中也发挥着重要作用。

值得一提的是：这些非编码RNA都是线性分子从5’开始到3’结束，在众多的非编码RNA中，存在一种特殊的共价闭合环状RNA分子—circRNA。从1976年首次在植物病毒中发现至今，CircRNA让我们对于RNA的功能又有了新的认识，目前对于CircRNA的认识也只是冰山一角，但是从最近的研究来看，CircRNA已经掀起一股新的研究热潮。

对于研究CircRNA来说，要解决的第一个问题就是先找到CircRNA。已经有相应的软件可以对CircRNA进行预测，比如find_circ、CIRCexplorer、CIRI，但是不同方法的差异非常大。这些CircRNA检测工具主要用于检测不含polyA的RNA测序数据或者用RNaseR处理过后的RNA测序数据。

因为CircRNA在经过富集之后可以很容易的被检测出来。然而，在做科学研究的时候，基于节约经费考虑，一般都是做total RNA测序，这些数据运用更多，信息量更大。因此，急需一个基于Total RNA测序结果能够准确预测CircRNA的工具。在这种情况下，UROBORUS应运而生。

•  UROBORUS预测CircRNA的主要步骤

准备工作：在运行UROBORUS.pl之前，电脑需要先装好下面三个软件

1、TopHat

2、Samtools

3、Bowtie

用TopHat工具将RNA reads mapping到基因组上，得到unmapped.sam文件。

UROBORUS以unmapped.sam作为输入数据。从unmapped.sam文件的reads两端提取长度为20bp的片段，形成一个末端配对的fastq文件（R20 1.fastq andR20 2.fastq）然后再用TopHat与人类参考基因组比对（默认允许两个碱基的错配）。

上面的比对结果可以得到两类连接的reads，Balanced Mapped Junction(BMJ) reads和Unbalanced Mapped Junction(UMJ) reads。BMJ reads指的是两端有至少20bp的碱基可以和两个back-spilced外显子的连接区配对，UMJ reads指的是一端有少于20bp的碱基可以和两个back-spilced外显子的连接区配对。

图1：UROBORUS预测CircRNA主要步骤简介

对UROBORUS软件进行综合测评

UROBORUS运用实例

选取了7个少突胶质细胞瘤，20个恶性胶质瘤和19个正常人的脑组织的Total RNA数据（去除rRNA）按照上面的操作步骤，分别预测了其中的CircRNA，结果发现：预测的结果中有已经被证实的CircRNA(circularHIPK3, CAMSAP1, MAN1A2, FBXW4, REXO4, ZKSCAN1, ZBTB44,FAM120A, MAP3K1, ZBTB46,NUP54, RARS, CRKL and XPO1)。

选取两个CircRNA，它们被UROBORUS鉴定出来的可能性。图2表示可能找到的跨越 Circular ERC1的14和15个外显子之间连接点的BMJ 和 UMJ reads，有30条明显跨越连接点的BMJ reads，但是却有43条只比对到Circular ERC1边界的UMJ reads。

另外，Circular CORO1C连接点的只有7条UMJ reads而不含BMJ reads，这表明只用BMJ reads的软件鉴定不到circular CORO1C，而 UROBORUS选取了BMJ和UMJ reads会使得它在检测CircRNA是更灵敏。

图2：Circular ERC1能被鉴定到的BMJ和UMJ reads，Circular CORO1C能能被鉴定到的UMJ reads

UROBORUS假阳性的概率

为了检测软件的假阳性概率，一般选择运行含有PolyA的RNA数据（不含CircRNA），理论上是不会有发现CircRNA的，如果有那就是假阳性。

用同样的方法，我们检查了UROBORUS假阳性的概率，在输入样本大小为127万条reads时，检测出2条reads 对应的一个CircRNA，假设所有已报道的CircRNA是假阳性的，UROBORUS的假阳性概率为每一百万reads约0.79。因此，预测UROBORUS的FDR < 0.013。

UROBORUS与find_circ和CIRCexplorer的比较

用这三个软件分别预测了前面的样本，根据表1的数据可知UROBORUS能预测到的CircRNA比find_circ多，但是少于CIRCexplorer，由于预测CircRNA的策略不同，CIRCexplorer在第一步的时候忽略了UMJ reads对应的CircRNA，并且过高的估计了能检测到的CircRNA的表达水平，它之所以能预测到更多的CircRNA是由于检测偏差造成的。

find circ会漏掉很多spanning reads很短的CircRNA和低估了它们的表达水平，这样就造成检测的到的CircRNA更少了。

表1：由UROBORUS、find_circ和CIRCexplorer鉴定到的CircRNA的数目

用Venn图表比较三个软件鉴定到的CircRNA，其中307个CircRNA是共有的，find circ能够鉴定出196与CIRCexplorer和 UROBORU不同的circRNAs；CIRCexplorer能够鉴定出 524与find circ和UROBORUS不同的circRNAs，UROBORUS 能够鉴定出 726 与find circ和CIRCexplorer不同的circRNAs。

这表明 UROBORUS 能够检测到更多新颖的circRNAs，基于它们不同的mapping和筛选策略，这三个软件可以当做互补的工具。并且在检测高表达的circRNA时，这3款软件效果类似。在运行上，UROBORUS占用的最大内存为6.3G，比另外两个大一点，同时运行10G的RNA测序数据时，UROBORUS要消耗4.8 h。

图3：A 用Venn图比较了三种软件鉴定到的CircRNA。

B当CircRNA检测高表达水平提高时，UROBORU和CIRCexplorer鉴定到了更多相似的CircRNA。

C 比较三种方法运用的语言、依赖的工具、内存和运行时间。

 总结

UROBORUS是一款基于Total RNA测序数据预测全转录组CircRNA的软件。

与CIRCexplorer和 find circ相比，UROBORUS在预测Total RNA中表达较低的CircRNA时准确率更高，使用起来也更加方便。

find circ所使用的是linux操作系统，对于生物学家来说要掌握这个并不容易，并且用find circ预测得到的CircRNA的数量明显少于CIRCexplorer和UROBORUS。CIRCexplorer是TopHat融合的修正，它分两步的mapping策略，第一步mapping会得到一个重叠区的索引，然后把所有没有与基因组mapping上的序列与第一步叠区的索引比对。

这样就必然造成忽略了UMJ reads对应的CircRNA，并且过高的估计了能检测到的CircRNA的表达水平。UROBORUS可以避免掉这些误差。

尽管，三个软件通过不同的策略寻找CircRNA，然而，当CircRNA表达水平提高时， UROBORUS能找到更多的普通的和高表达的CircRNA，更重要的是，当CircRNA表达水平很低时，UROBORUS也能精确的预测到，这点是findcirc 和CIRCexplorer所无法达到的。

本软件不足之处在于，只能检测外显子之间连接产生的CircRNA，不能预测出内含子之间连接和基因间隔区连接形成的CircRNA。

尽管内含子之间连接和基因间隔区连接形成的CircRNA只占总CircRNA的一小部分，然而我们在为下一代的UROBORUS研发而努力，希望可以检测到更多内含子之间连接形成的CircRNA。

下载文献：circular-rna-profile-in-gliomas-revealed-by-identification-tooluroborus