文章来源：中华内分泌代谢杂志, 2019,35(2): 114-120

作者：叶阳 祝超越 肖元元 高清歌 刘梦丹 冀琳琳 徐立 魏丽

目的

探索2型糖尿病(T2DM)患者外周血中环状RNA(circRNA)的差异性表达，寻找T2DM的诊断标志物。

方法

采用微阵列分析从3个正常人和3个T2DM患者外周血中严格筛选出数个差异表达circRNAs。扩大样本量[对照组(NC)20人，糖调节异常(IGR)20人，2型糖尿病(T2DM)20人]，利用荧光定量PCR(Q-PCR)测定，进一步筛选差异性最明显的一个circRNA，对确定的circRNA再进行扩大样本验证(50个NC、50个IGR和50个T2DM样本)。

结果

微阵列分析共发现2 953个差异表达的circRNAs，其中表达上调的为1 439个，表达下调的为1 514个。从表达上调的1 439个环状RNA中严格筛选出9个差异表达的circRNAs(hsa-circ-103838、hsa-circ-103965、hsa-circ-104227、hsa-circ-002117、hsa-circ-000094、hsa-circ-101226、hsa-circ-101720、hsa-circ-400029、hsa-circ-100633)作为候选诊断标志物。扩大样本后(n＝60)Q-PCR结果显示9个circRNAs中hsa-circ-000094(别名：hsa-circ-0000247)在3组人群中差异表达最明显，通过ROC曲线分析发现其具有最大曲线下面积(AUC)，SIGR＝0.802 5[95%置信区间(0.665 5-0.939 5)，P＝0.001]；ST2DM＝0.77[95%置信区间(0.624-0.916)，P＝0.003]。为了进一步验证Hsa-circ-000094的临床诊断能力，进行再扩大样本(n＝150)实验，结果显示Hsa-circ-000094在3组人群中的表达具有差异性，差异性及ROC曲线分析具有统计学意义，SIGR＝0.673 3[95%置信区间(0.575 7-0.771 0)，P<0.01]；ST2DM＝0.723 1[95%置信区间(0.632 7-0.813 4)，P<0.01]。

结论

外周血hsa-circ-000094的高表达对IGR和T2DM提供了一定的诊断依据。

糖尿病在全世界的发病率有逐年增高的趋势，已经成为世界上继肿瘤、心脑血管病之后第3位严重危害人类健康的慢性疾病。目前糖尿病对人类健康危害最大的是在动脉硬化及微血管病变基础上产生的多种慢性并发症，主要是危害心、脑、肾、血管、神经、皮肤等。近年来，随着基因组学的发展，编码一些复杂疾病序列的单核苷酸多态性(SNP)的相关位点已经逐渐被发现[1,2]。科学家们发现人类基因组可以被广泛地转录成非编码的RNA，这些RNA与很多疾病都有着密切的联系[3]。目前已经在真核细胞中发现了大量内源性circRNAs，其中一些circRNAs表达丰度高并呈现出时空表达特异性和物种间保守性。在生物信息学快速发展和高通量测序技术不断革新的基础上，近年来发现circRNAs在神经系统紊乱、糖尿病和肿瘤等疾病发生过程中起着较为重要的作用[4,5,6,7]，深入研究circRNAs的结构和功能可使我们更好地了解疾病的发生机制，提高相关疾病的预防和诊断水平。本研究通过检测hsa-circ-000094等circRNAs在3组不同人群外周血中的表达情况，探讨这些circRNAs是否具有作为糖尿病诊断标志物的可能性。

对象和方法

一、 对象

样本选取于上海市第六人民医院东院2015年10月至12月进行上海某社区853人糖尿病筛查时留取的静脉外周血。所有人均接受75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。糖尿病诊断符合1999年WHO的糖尿病诊断标准[8]：(1)糖尿病症状加随机血糖≥11.1 mmol/L或(2)空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或(3)葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。糖调节异常诊断：空腹血糖在6.1～7.0 mmol/L之间，糖耐量2 h血糖在7.8～11.1 mmol/L。

排除标准：排除肿瘤，肝肾功能不全，急慢性炎症，自身免疫性疾病，高血压和其他内分泌疾病，同时对每个样本做了抗体排除LADA、MODY，样本抗体结果均呈阴性。根据临床和人口学特征选取样本总计246人。其中男111例，平均年龄(58.1±7.9)岁；女135例，平均年龄(50.5±8.3)岁；根据以上标准分为83例对照组(NC)，80例糖调节异常组(IGR)以及83例2型糖尿病组(T2DM)。本研究经上海市第六人民医院东院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

二、 方法

本次实验研究包括三步独立的实验。第一步：挑选3个对照组样本和3个2型糖尿病组总RNA样本进行微阵列分析实验。通过差异性表达分析获得了9个特异性的circRNAs。第二步：对9个环状RNA进行扩大样本验证，分别选取20个NC、20个IGR和20个T2DM样本，进行荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)定量分析。第三步，选取最有诊断价值的环状RNA，进行再扩大样本实验，分别选取50个NC、50个IGR和50个T2DM样本，验证此circRNA作为诊断标志物的特异性和敏感性。

1．RNA的抽提和逆转录：

人外周血中的总RNA采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)一步提取法，使用紫外分光光度仪(Nanodrop 2000，美国)测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。采用Fast Quant RT Kit(天根生物，北京)合成第一链cDNA。

2．Q-PCR：

circRNAs双引物由引物设计软件Primer 5.0设计，交由上海生工合成。Q-PCR采用SYBR-Green法，20 μl反应液体系(上海生工)：2×Fast qPCR Master Mix 10 μl，Forward Primer 0.4 μl，Reverse Primer 0.4 μl，逆转录反应产物(1∶30稀释)2 μl，DNF Buffer 2 μl, DEPC水5.2 μl。在实时定量PCR仪(Roche lightcycle 480)上进行扩增，反应条件为：95℃ 3 min，95℃ 3 s，60℃ 20 s，40个循环。反应结束由计算机自动计算各反应管Ct值。采用2－ΔΔCt法进行相对定量。

3．环状RNA微阵列分析：

微阵列分析使用3个NC样本和3个T2DM样本的Arraystar人circRNA阵列V1分析。使用NanoDrop ND-1000对各样品的总RNA进行定量，基于Arraystar的标准协议进行的样品制备和芯片杂交。通过安捷伦的特征提取软件(版本11.0.1.1)来分析获得的阵列图像，使用R软件包进行分位数归一化和随后的数据处理。采用层次聚类方法对不同样本之间的可识别环状RNA表达模式进行演示。

三、 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计，正态分布的数据以Mean±SD描述，两组间比较采用独立样本的t检验。ROC曲线分析，当AUC大于0.5时，circRNA被定义为有诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、 糖尿病患者外周血环状RNA的差异性表达谱

选取3个对照组和3个2型糖尿病样本进行高通量测序及微阵列分析。结果显示，两组人群环状RNA表达谱有差异，共发现2 953个差异表达的环状RNA，其中表达上调的为1 439个，表达下调的为1 514个(图1)。同时通过Volcano Plot过滤，确定了两组环状RNA之间具有统计学意义的差异表达(图2)，并从表达上调的1 439个环状RNA中挑选9个符合标准的circRNAs候选标志物，分别是hsa-circ-103838、hsa-circ-103965、hsa-circ-104227、hsa-circ-002117、hsa-circ-000094、hsa-circ-101226、hsa-circ-101720、hsa-circ-400029和hsa-circ-100633。

图1 NC和T2DM外周血微阵列分析热图

注：通过分层聚类分析产生热图，以显示NC和T2DM外周血之间的表达上调和下调的circRNAs Generation of heat maps by hierarchical cluster analysis to show up-regulated and down-regulated circRNAs between non-diabetic and diabetic peripheral blood；色标显示不同样品中circRNAs的相对表达水平，红色代表上调，绿色代表下调The color scale shows the relative expression level of circRNAs in different samples, red for up-regulation and green for down-regulation；图左侧样本缩写后的A和B分别代表NC和T2DM A and B after the sample abbreviations on the left side of the figure represent NC and T2DM, respectively

图2 NC和T2DM外周血circRNAs差异表达火山图

二、 Q-PCR验证候选环状RNA及ROC曲线分析

为了验证候选环状RNA在3组人群中是否存在表达差异，选取20个NC，20个IGR，20个T2DM的RNA样本，经过Q-PCR技术验证，其中hsa-circ-104227、hsa-circ-002117、hsa-circ-101226、hsa-circ-400029、hsa-circ-100633在3组人群中的表达没有差异特征。Hsa-circ-000094，hsa-circ-103965在3组人群中差异表达明显，从NC至T2DM的表达量呈逐步增加的趋势(图3A、B)。Hsa-circ-101720，hsa-circ-103838在IGR和T2DM中没有明显差异，但表达量都高于NC(图3C、D)。

注：A、B、C、D分别表示hsa-circ-000094、hsa-circ-103965、hsa-circ-101720、hsa-circ-103838在3组人群中的表达水平(n＝20) A, B, C, and D represent the expression levels of hsa-circ-000094, hsa-circ-103965, hsa-circ-101720, and hsa-circ-103838 in three groups respectively(n＝20)；bP<0.05，cP<0.01

图3 通过Q-PCR定量测定所选取的环状RNA的表达水平

通过对hsa-circ-103965、hsa-circ-000094两个circRNAs的ROC曲线分析，hsa-circ-000094在诊断IGR和T2DM的曲线下面积分别是0.802 5[95%置信区间(0.665 5～0.939 5)，P＝0.001]和0.77[95%置信区间(0.624～0.916)，P＝0.003](图4A、B)，hsa-circ-000094的IGR敏感性为0.75，特异性为0.65，T2DM敏感性为0.80，特异性为0.45(表1)。hsa-circ-103965在诊断IGR和T2DM的曲线下面积分别是0.767 5[95%置信区间(0.623 1～0.911 9)，P＝0.003]和0.71[95%置信区间(0.550 2～0.869 8)，P＝0.023，图4C、D]。hsa-circ-103965的IGR敏感性为0.85，特异性为0.40，T2DM敏感性为0.80，特异性为0.35(表1)。根据ROC曲线分析，选取hsa-circ-000094作为诊断IGR和T2DM的候选标志物，并且进行临床大样本验证。

图4 circRNAs对IGR和T2DM诊断的ROC曲线分析

注：A、C代表的是hsa-circ-000094，hsa-circ-103965对IGR诊断的ROC曲线A and G represent the ROC curves of hsa-circ-000094 and hsa-circ-103965 for IGR diagnosis；B、D代表的是hsa-circ-000094，hsa-circ-103965对T2DM诊断的ROC曲线B and D represent the ROC curves of hsa-circ-000094 and hsa-circ-103965 for T2DM diagnosis；每幅图都给出了ROC曲线下面积的具体值Each figure gives the specific Auc value on the graphs

三、 生物标志物的进一步大样本临床验证

为了验证hsa-circ-000094临床诊断能力，我们对hsa-circ-000094进行独立的扩大样本研究，将样本量增加至50个NC，50个IGR，50个T2DM(图5A)。结果显示，hsa-circ-000094的表达量在3组人群中呈现递增的趋势，与扩大样本前的表达趋势一致。同样地，我们也进行了ROC曲线分析来验证其诊断的敏感性以及特异性。Has-circ-000094在IGR的曲线下面积为0.673 3[95%置信区间(0.575 7～0.771 0)，P<0.01]，敏感性为0.704 9，特异性为0.506 6(图5B)。在T2DM的曲线下面积为0.723 1[95%置信区间(0.632 7～0.813 4)，P<0.01]，敏感性为0.754 1，特异性为0.475 4(图5C)。根据以上实验结果可以得出结论：has-circ-000094在NC、IGR以及T2DM中的表达量具有差异性，提示hsa-circ-000094是诊断IGR和T2DM的潜在的生物标志物。

注：A表示hsa-circ-000094在扩大样本后的3组人群中的表达依次呈上升趋势A indicates that the expression of hsa-circ-000094 in the three groups after the expansion of the sample increased in turn(n＝50)，bP<0.05，cP<0.01；B、C分别表示hsa-circ-000094在IGR和T2DM诊断的ROC曲线，每幅图都给出了ROC曲线下面积的具体值B and C represent the ROC curves of hsa-circ-000094 diagnosed in IGR and T2DM respectively, each figure gives the specific Auc value on the graphs

图5 Hsa-circ-000094在扩大样本后的表达及ROC曲线分析

讨论

一、 环状RNA的功能以及与T2DM发生的关系

环状RNA就是一类闭合成环的非编码RNA，是由外显子、内含子或者外显子和内含子共同构成[9,10]，其不受核酸外切酶的影响，比线性RNA更加稳定[11,12]。circRNAs是一个全新的领域，目前研究者认为circRNAs主要通过以下四种方式起作用：

(1)作为micro RNA海绵，通过吸附microRNA而抑制其功能；

(2)与蛋白质结合，从而抑制蛋白质活性；

(3)通过碱基互补配对直接调控其他RNA；

(4)少部分circ RNA可作为翻译的模板，指导蛋白质的合成，其最重要的功能就是可以作为miRNA的海绵体，这是一种通过竞争结合miRNA来调节miRNA靶基因的转录[13,14]。如circCDRas可超过70个microRNA结合靶点，通过吸附miR-7而调节人EGFR、α-突触核蛋白和胰岛素受体底物2[15]。小鼠的环状RNA circ Sry有10个mi R-138的结合位点[16]。近

期的一项研究发现circ HIPK3可吸附9种microRNAs，还可通过直接结合mi R-124而抑制mi R-124的功能[17]。这些circ RNAs有许多特定的micro RNAs结合位点，可能更有效地通过结合microRNA而调控下游靶基因的功能。

本实验研究中，我们运用高通量测序技术对3例T2DM样本和3例NC样本进行了高通量测序，获得了circRNAs表达谱，共筛选出2 953个circRNAs。通过火山图分析发现这些差异表达circ RNAs中的大部分在T2DM组中是上调表达的，而不是下调表达与上调表达数量类似或下调表达的circRNAs更多。我们推测，差异表达的circRNAs大部分起到T2DM的易感作用。circRNA分子结构较为特殊，与线性RNA分子的PCR引物不同，为了能检测到特异性的环状分子，circRNA的引物设计为双向引物，通过realtime PCR扩增后检测到circRNA的剪接位点就能证明该双向引物能够扩增出特异性产物，从而可用Q-PCR法检测特定circRNA在某样品中的表达情况。我们根据Has-circ-000094的序列设计了双向引物并在其Q-PCR产物中检测到Has-circ-000094特异性的剪接位点；用这对特异性双向引物通过Q-PCR法检测了246例样本中Has-circ-000094的表达量，发现Has-circ-000094在3组人群中的表达量与高通量测序结果类似，证实了高通量测序结果的可靠性。查阅近几年关于circRNAs与T2DM的国内外文章，有研究发现外周血中has-circ-0054633在3组人群中的表达量呈递增趋势，同时具有最大的曲线下面积，呈现出对T2DM的一种诊断能力[18]。此发现也验证了circRNAs可作为T2DM诊断标志物的潜能。然而我们并没有发现有关has-circ-000094和糖尿病之间关联的报道，本实验是首次研究hsa-circ-000094在NC、IGR和T2DM样本中的表达，且在3组人群中表达呈上升趋势。

二、 Has-circ-000094作用下游靶基因的预测

高通量测序技术及生物信息学分析的快速发展，给T2DM的基础研究带来极大的便利。利用该技术，T2DM中大量异常表达的基因被发现，结合生物信息学分析，研究人员能够更加有方向性地靶定目的基因并进行深入研究。Has-circ-000094的全序列为ACAT-TCGCAGGTCTTTCACTACCATTCCTACAGTGATTGGC-AAGAT，是由46个碱基组成的小分子非编码RNA。我们利用生物信息学技术(http：//www.mirbase.org/)预测到可能与hsa-circ-000094结合的miRNA，它们分别是hsa-miR-98-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-370-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7a-5p。通过双荧光素酶报告基因实验发现hsa-circ-000094与hsa-miR-370-5p的结合效率最高。Li等[19]认为hsa-miR-370-5p可以激活P21基因的表达；而Ahn等[20]研究发现，2型糖尿病患者胰岛80%缺乏p21(Cdc42/Rac)激酶PAK1，PAK1涉及β细胞功能和维持β细胞团，PAK1缺乏可能导致2型糖尿病易感性增加。据此我们提出hsa-circ-000094作用机制的猜想：2型糖尿病患者中hsa-circ-000094的高表达抑制了hsa-miR-370-5p的活性，从而使hsa-miR-370-5p作用的下游基因P21的表达和活性下降，继而引起激酶PAK1的功能丧失，最终导致2型糖尿病的发生。

小结：本实验选取的糖尿病血样本均为单纯糖尿病患者，是为了排除糖尿病并发症的干扰因素，实验结果显示外周血中的Hsa-circ-000094在3组人群中存在差异性表达，提示该circRNA对糖尿病具有一定的诊断价值。Hsa-circ-000094可以通过外周血检测，其低成本、高特异性和敏感性，使之成为诊断T2DM和IGR的一个潜在的、实用的工具[21,22]，同时也具有对糖尿病早期风险预警的作用。而Hsa-circ-000094在伴随糖尿病相关并发症的患者外周血中的表达和Hsa-circ-000094与下游miRNA作用的具体机制将是我们下一阶段的主要研究方向。此外，这是一个单中心研究，研究对象的地理位置比较集中，其他地区的人口是否也有类似的基因表达谱，目前尚不清楚。因此，我们的研究结果需要在更大更多样化的人群中进行进一步验证。相信阐明具体机制会将糖尿病的诊疗带进一个全新的领域。