撰文 | 福小姐，责编 | 兮（bioart微信公众号）

 

在细胞内，RNA适体（RNA aptamer）可通过与目标蛋白的特异性结合来抑制或调节其功能，具有非常高的潜在临床应用价值，目前处于临床研究阶段的RNA适体已有不少进入到临床2期。

利用U6启动子进行转录，RNA适体的表达量只有几nmol/L，半衰期约0.25-1.25 h；而细胞内蛋白质的表达量约为几十、几百nmol/L甚至μmol/L级别【1】。因此，表达量低、稳定性差导致RNA适体很难在细胞内发挥调节目标蛋白功能的作用。基于RNA适体的分子传感器（RNA-based devices/biosensors）通常由产生荧光信号的RNA适体（如Spinach）和特意结合目标分子的RNA适体组成。在细菌体内，这类RNA分子传感器的表达量可达到μmol/L级别【2】，能够对多种代谢物和信号分子进行实时荧光成像。但是，在哺乳动物细胞内，RNA分子传感器的表达量在nmol/L级别【1】，其产生的荧光信号很难被检测。

近日，来自美国康奈尔大学的Samie Jaffrey教授课题组在Nature Biotechnology上在线发表题为Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts的研究性论文，该课题组通过建立一种新的“Tornado”表达系统实现了细胞内环状RNA适体和RNA分子传感器高水平表达及功能应用。

所谓“Tornado”即“Twister-optimize RNA for durable overexpression”表达系统，如图1所示。其转录本由聚合酶III启动子、终止子序列（黑色）、目标RNA适体序列（绿色）、5’端Twister核酸酶序列（深蓝色）、3’端Twister核酸酶序列（浅蓝色）和5’、3’连接序列（咖啡色）组成。在细胞内，该系统首先转录生成pri-racRNA序列；然后，在5’、3’ Twister核酸酶作用下，pri-racRNA序列发生自我催化切割，生成5’端为羟基，3’端为2’,3’-环磷酸的pre-racRNA序列；最后，在体内RNA连接酶RtcB作用下，连接形成环状RNA适体（racRNA）。该方法无需共表达任何蛋白酶即可实现RNA快速、高效环化，提高RNA适体在细胞内的稳定性和半衰期。

图1

作者以可结合发色团DFHBI-1T并产生荧光的RNA适体Broccoli为目标序列，对“Tornado”系统进行表征和优化。他们发现，当3’端核酸酶为Twister P1、5’端核酸酶为Twister P3 U2A时，环状RNA表达量最高（图2a）。与线性Broccoli、tricY-Broccoli相比，“Tornado”系统转录的环状Broccoli在细胞内荧光最强（图2b）。通过计算，环状Broccoli在不同细胞系内的表达量均达到了μmol/L级别（21 μM in HEK293T，16 μM in Hela，1.6 μM in HepG2）（图2c）。

图2

利用“Tornado”表达系统，环状RNA适体可在细胞体内对信号蛋白进行有效调节。作者以NF-kB蛋白为例，设计“Tornado”系统转录表达了包含NF-kB适体和Broccoli的环状RNA（图3a），并评估了其对NF-kB的抑制作用。他们发现，环状RNA适体对NF-kB通路活性的抑制效率达到了65%，远高于线性RNA适体的抑制作用（8%），（图3b）。

图3

最后，作者利用“Tornado”系统表达的环状RNA分子传感器实现了对细胞内代谢物的动态、实时荧光成像及检测。以胞内S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM）为目标代谢物，作者设计并表达了包含SAM适体和Broccoli的环状RNA分子传感器（图4a）。当向细胞培养液中加入SAM合成抑制剂cycloleucine时，细胞内SAM含量逐渐减少，环状RNA分子传感器的荧光逐渐减弱；撤去抑制剂cycloeucine后，细胞内SAM水平逐渐增加，环状RNA分子传感器的荧光也随之恢复（图4b）。

图4

综上，“Tornado”表达体系实现了RNA适体在哺乳动物细胞内的高水平、高稳定性的表达，为将来基于RNA技术在哺乳动物细胞内的广泛应用奠定了基础。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0090-6

制版人：子阳

参考文献

1. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W. & Jafrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chem. Biol. 22, 649–660 (2015).

2. Paige, J. S., Nguyen-Duc, T., Song, W. & Jafrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science 335, 1194 (2012).