转自：汉恒生物（微信公众号）| 作者：HHJ

前言

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，也是在世界女性癌症致死率中排在第二位的恶性肿瘤。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer ，TNBC）是最恶性的乳腺癌亚型，发病率占所有乳腺癌患者的约15％。

近年来，环状RNA（circular RNAs ，circRNA）作为一种新的非编码RNA，被报道参与许多人类疾病的发生和进展（包括癌症），并发挥重要调控作用。然而，circRNA在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer ，TNBC）中潜在的分子调控机制和临床特征都还不清楚。

重庆医科大学的陈俊霞教授团队在circAGFG1在三阴性乳腺癌疾病进程中的分子调控机制研究方面取得突破性进展。相关研究成果以“The circRNA circAGFG1 acts as a sponge of miR-195-5p to promote triple-negative breast cancer progression through regulating CCNE1 expression”（circAGFG1充当miR-195-5p的海绵，通过调节CCNE1表达促进三阴性乳腺癌进展）为题，于2019.01.08在国际著名学术期刊Mol Cancer上在线发表，影响因子IF=7.776。

研究者首先通过RNA测序分析4对TNBC组织和相邻癌旁组织中的circRNA表达谱，筛选到circAGFG1分子，并使用qRT-PCR和原位杂交来确定TNBC组中circAGFG1的水平。结果表明TNBC中circAGFG1明显上调，其水平与TNBC患者的临床分期，病理分级和预后不良有关。circAGFG1可以促进TNBC细胞增殖，迁移和侵袭以及体内肿瘤的发生和转移。分子机制研究分析显示，circAGFG1可作为miR-195-5p的竞争性内源RNA（ceRNA）以减轻miR-195-5p对其靶基因细胞周期蛋白E1（CCNE1）的抑制作用，circAGFG1通过circAGFG1 / miR-195-5p / CCNE1信号途径促进TNBC疾病进展。

图1. circAGFG1和CCNE1在TNBC中上调并且与疾病进展和不良预后相关。

a：circAGFG1基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证和DNA测序进行剪接位点验证；b：qRT-PCR检测circAGFG1在TNBC肿瘤组织（癌旁组织做对照）的相对表达（n = 40）；c：通过qRT-PCR确定细胞系中circAGFG1的相对表达；d：通过ROC曲线评估circAGFG1对TNBC的诊断价值；e：ISH测定检测circAGFG1在TNBC组织中表达；f：根据TNM分期分析具有circAGFG1低表达或高表达的样本百分比；G：根据circAGFG1表达分析80名TNBC患者的Kaplan-Meier总生存期生存曲线，以中位数来区分高表达和低表达组；h：qRT-PCR检测CCNE1在TNBC肿瘤组织（癌旁组织做对照）中的相对表达（n = 40）；i：TNBC组织中circAGFG1和CCNE1表达的Pearson相关性分析（n=20）。j：采用TCGA数据分析TNBC肿瘤组织和癌旁组织（对照）中CCNE1的相对表达；k：基于TCGA数据在103名TNBC患者中分析Kaplan-Meier总生存期生存曲线。

图2. circAGFG1促进TNBC细胞增殖。

a：circAGFG1表达载体和shRNA的示意图。b和c：qRT-PCR检测circAGFG1和AGFG1在转染了circAGFG1，mock，sh-circ，sh-NC的TNBC细胞中的表达；d：CCK8测定过表达和干扰circAGFG1细胞的生长曲线；e和f：EdU测定转染了不同质粒的细胞增殖情况；g和h：菌落形成实验检测转染了不同质粒的细胞增殖情况。

图3. circAGFG1促进TNBC细胞迁移和侵袭，并调节细胞周期和细胞凋亡。

a和b：划痕实验检测细胞迁移能力；c和d：Transwell测定细胞侵袭能力；e和f：流式细胞术分析细胞周期；g和h：流式细胞术分析细胞凋亡率；i和j：TUNEL法检测细胞凋亡；k：WB测定凋亡相关蛋白的表达水平。

图4. circAGFG1促进体内TNBC细胞的肿瘤发生及血管生成和转移。

a：异种移植瘤，每组3个；b：统计数据显示肿瘤重量；c：异种移植肿瘤的生长曲线；d和e：对肿瘤和肺组织进行切片和HE染色展示了肿瘤的微血管和肺的转移性结节；f：WB检测CCNE1蛋白表达水平；g：IHC检测细胞周期分子蛋白表达水平。

图5. circAGFG1作为miR-195-5p的海绵起作用。

a：由targetScan和miRanda预测的circAGFG1上的miR-195-5p结合位点；b和c：FISH检测观察细胞中circAGFG1（红色）和miR-195-5p（绿色）的定位；d：通过qRT-PCR测定miR-195-5p在TNBC组织和邻近癌旁组织中的相对表达；e：采用TCGA数据分析，与对照组织相比TNBC组织中miR-195-5p的相对表达；f基于TCGA数据分析总生存率的Kaplan-Meier生存曲线（n = 100）。g：circAGFG1-WT和circAGFG1-Mut荧光素酶报告载体示意图。h：分别用circAGFG1-WT或circAGFG1-Mut和miR-195-5p mimic或miR-NC转染293T细胞后检测相对荧光素酶活性；i和j：miR-195-5p mimic或miR-NC转染MDA-MB-231细胞后，开展anti-AGO2 RIP实验及WB和qRT-PCR实验分别检测AGO2蛋白，circAGFG1和miR-195-5p表达；K：在MDA-MB-231细胞中进行RNA pull down实验及qRT-PCR检测circAGFG1和miR-195-5p的富集水平；l：qRT-PCR检测转染质粒的MDA-MB-231细胞中miR-195-5p的相对表达；m：TNBC组织中circAGFG1和miR-195-5p表达的Pearson相关性分析。

图6. miR-195-5p直接靶向CCNE1基因，这一过程受circAGFG1表达水平的调节。

a：CCNE1 3'UTR-WT，3'UTR-Mut和CCNE1的荧光素酶报告载体示意图；b：分别转染CCNE1 3'UTR-WT或CCNE1 3'UTR-Mut和miR-195-5pmimic或miR-NC后，在293 T细胞中检测相对荧光素酶活性；c和d：分别转染miR-NC，miR-195-5p，ihn-NC和inh-195-5p后，检测细胞中CCNE1的相对mRNA和蛋白质水平；e和f：qRT-PCR检测转染了circAGFG1，mock，shNC，sh-circ和miR-195-5p或inh-195-5p的细胞中CCNE1的相对表达水平。

图7. circAGFG1通过circAGFG1 / miR-195-5p / CCNE1信号途径促进细胞增殖和侵袭。

本研究发现circAGFG1在在三阴性乳腺肿瘤中高水平表达，并揭示了circAGFG1作为miR-195-5p的sponge减轻miR-195-5p对其靶基因CCNE1的抑制作用进而促进TNBC进程的分子机制。因此，circAGFG1可作为治疗TNBC患者的新诊断标志物或靶点，具有潜在的临床应用价值。