转自：上海元莘生物（微信公众号）作者：元元

发表期刊：《Ann Rheum Dis》
影响因子：12.35
出版日期：2019年2月28日
客户单位：浙江大学医学院附属邵逸夫医院
课题组：范顺武教授带领的骨科课题组
文章第一作者：沈舒滢

研究背景

骨关节炎(OA)是一种增龄性或创伤后退行性的关节疾病，其特点是透明关节软骨的逐渐丧失，并伴随软骨下骨的硬化改和骨刺增生。阐明调控细胞外基质(ECM)降解相关基因表达的机制对于开发有效的OA治疗方法至关重要。Circular RNAs (CircRNAs)是一类特殊的非编码RNA，与传统线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状，不受RNA外切酶影响，表达稳定，不易降解。CircRNA富含microRNA (miRNA) 结合位点，在细胞中起到miRNAsponge作用，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因表达，在疾病中发挥重要调控作用。本文利用全转录组测序(circRNA-seq,miRNA-seq,mRAN-seq)检测 3个OA患者和3个对照样本的软骨组织RNA表达，利用转录调控分析以及RT-qPCR，FISH，WB等试验技术鉴定出关键circRNA(CircSERPINE2)，miRNA(miR-1271)和靶基因(ERG)。结合RNA干扰、过表达、兔模型关节内注射等实验证明CircSERPINE2表达升高可通过mir-1271-ERG途径抑制HCs凋亡，从而抑制ECM分解代谢，促进合成代谢，对缓解OA有积极作用。

样本信息

浙江大学医学院附属邵逸夫医院

病理组：髋关节炎症状末期患者30名

对照组：无OA病史的股骨颈部骨折患者30名

研究内容

circRNA研究的人这么多，为何这篇文章能发如此高分？让我们来梳理一下它的研究路线！

Step1:筛选关键circRNA

既然是研究circRNA的调控作用，当然得先确定circRNA，看看沈老师是怎么做的

CircRNA在人类OA及正常组织中的表达模式

通过对三个临床OA和三个对照组织的circRNA-seq，得到了OA与对照组中circRNA的表达差异结果，与在OA中表达为上调的SERPINE2不同，CircSERPINE2 在OA组织中表达相对较低，对COL2A1、MMP3、MMP13和SOX9的免疫印迹法（WB），揭示了hsa_circ_0008365的保护作用。用Sanger测序确定了hsa_circ_0008365 是由Serpine2基因的外显子第二到第四个外显子组成（CircSERPINE2），是由5’端剪接位点和外显子3’端相应位点形成的特殊剪接反应。FISH和RT-qPCR分析表明CircSERPINE2在HCs细胞质中表达量丰富。

图1.CircSERPINE2在人类OA及正常组织中的验证和表达

CircSERPINE2在软骨细胞中对凋亡及ECM代谢的调节

CircSERPINE2表达基因的敲除对SERPINE2没有影响，但会增加软骨细胞凋亡率。IL-1β处理后软骨细胞凋亡率明显升高，而这个升高率会被CircSERPINE2的过表达明显抑制。此外，抑制CircSERPINE2的表达促进了MMP3、MMP13和ADAMTS4的表达，降低了SOX9、COL2A1和Aggrecan的表达。CircSERPINE2表达基因的敲除影响了HCS和SW1353细胞中MMP13、ADAMTS 4、COL2A1和Aggrecan的表达。这些数据清楚地表明了敲除CircSERPINE2基因在HCS和SW1353细胞中的促凋亡和促代谢作用。

图2.CircSERPINE2表达基因的敲除诱导软骨细胞中基质降解酶的表达

Step2:筛选关键miRNA

找到了circRNA,接下来就得找到它所作用的关键miRNA分子

CircSERPINE2是miRNAs的sponge

通过对三个临床OA和三个对照组织的miRNA-seq，再经miRanda，TargetScan 等方法锁定miR-1271，WB结果表明miR-1271与基质降解和合成组分的蛋白表达有关。RT-qPCR和FISH等实验进一步证实了CircSERPINE2与miR-1271的结合情况。miR-1271表达升高的细胞显示细胞凋亡率增加，并增强MMP3、MMP13和ADAMTS4的表达，降低SOX9、COL2A1和Aggrecan的表达水平。相反，miR-1271的表达抑制对基质降解和合成组分产生相反的影响。

图3.CircSERPINE2在HC细胞中是miR-1271的海绵

Step3:体内体外实验验证circRNA是如何通过miRNA来对OA产生影响

找到关键的circRNA和miRNA分子，再确定它们具体调控的编码基因后，设计体内体外实验验证circRNA的功能

CircSERPINE2在OA中通过靶向miR-1271的表达发挥作用

miR-1271海绵腺病毒含有与miR-1271重复的互补结合位点，并使miR-1271在细胞中持续失去功能。与单独感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海绵腺病毒的细胞相比，共感染细胞中MMP13、MMP3和ADAMTS4的蛋白和mRNA水平显著降低，而SOX 9、COL2A1和Aggrecan的蛋白和mRNA水平显著升高。表明CircSERPINE2通过靶向miR-1271发挥作用。

图4.miR-1271表达基因敲除可逆转CircSERPINE2诱导的HC中软骨退化

miR-1271直接靶向ETS相关基因

ERG在OA所致软骨损伤区明显下调，显示了ERG在OA发病机制中的潜在作用。miR-1271模拟物降低了ERG蛋白和mRNA的表达，而miR-1271抑制剂发挥了相反的作用。此外，ERG过表达降低了MMP3、MMP13和ADAMTS4的表达，增加了SOX9和COL2A1的表达。表明miR-1271靶向ERG，内源性ERG的表达与OA发病密切相关。pre-miR-1271腺病毒感染导致ERG表达受到抑制。与阴性对照细胞相比，pre-mir-1271腺病毒感染显著降低了HCS中COL2A1,SOX9和Aggrecan的表达水平，而MMP3,MMP13和ADAMTS4表达水平明显升高。然而，这些效应在ERG过度表达后被取消。综上所述，表明mir-1271表达升高可能通过ERG损害软骨细胞的表型。

图5.ERG是miR-1271的直接靶点，介导miR-1271在HC细胞中发挥作用

在兔模型中注射CircSERPINE2可减缓OA

将WT或MUT腺相关病毒(AAV)CircSERPINE2关节内注射于前交叉韧带横断(ACLT)诱导的OA兔体内，当仅注射WTAAV CircSERPINE2时，软骨表面获得改善。OARSI评分显示，WT AAV CircSERPINE2能显著降低OARSI评分，而MUT AAV CircSERPINE2处理会增加OARSI评分。显微CT图像显示OA兔骨刺增多，而CircSERPINE2关节内注射导致骨刺减少。免疫组化和WB结果显示，WT AAV CircSERPINE2能减轻兔OA模型的软骨基质退行性改变，如增强凋亡和分解反应，增加ECM成分。综上所述，这些结果表明CircSERPINE2在体内表达升高对抑制ECM分解代谢而促进合成代谢，缓解OA有积极作用。

图6.CircSERPINE2能在体内缓解OA

研究结论

1.揭示了一个新的. circRNA (CircSERPINE2)在OA发病过程中的重要作用；

2.CircSERPINE2表达升高可通过mir-1271-ERG途径抑制HCs凋亡，促进ECM的合成代谢；

3.提供了一种潜在有效的OA发病过程中的治疗策略

文章索引:Shuying Shen, Yizheng Wu, et al.,CircSERPINE2 protects against osteoarthritis by targeting miR-1271 and ETS-related gene,Ann Rheum Dis. 2019 Mar 28.