（2）circNfix下调可诱导心肌梗死后心脏再生：心肌梗死前、梗死后1、14、28天超声心动图分析心功能（A）。射血分数的定量分析(EF)及缩短分数(FS)（B-C）。小鼠体内转染sh-circnfixo28天后的小鼠心脏得分（D）。心肌梗死后14、28天小鼠心室横切面TTC染色（E）。心肌梗死后14天和28天Masson染色的心脏切片代表性图像（F）。心脏切片中纤维化区域的定量分析（G）。心肌梗死后shcircNfix组Kaplan-Meier生存曲线分析（H）。

转录因子：

（1）转录因子Meis1通过结合Nfix位点的SE驱动circNfix表达：H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心脏组织Nfix位点的ChIP-seq谱（云序生物提供该服务）（A）。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心脏组织Nfix位点的保守性评分，以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq（云序生物提供该服务）（B）。SE与circNfix启动子区looping事件的3C-qPCR分析（C）。四种成分增强子(E1、E2、E3、E4)构建的pgl3启动子报告载体荧光素酶检测（D）。Meis1沉默后P7 CMs中野生型E2和突变E2的荧光素酶活性（E）。circNfix-SE中孵育Meis1结合位点被DIG-ddUTP标记寡核苷酸探针后，P7 CMs中提取的核蛋白的EMSA结果（F）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示Meis1结合位点在circNfix-SE中扩增（G）。QRT-PCR检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix和Nfix mRNA的表达水平（H）。RNA FISH 检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix的亚细胞定位（I）。EdU染色检测Meis1和circNfix干扰后对P7 CMs增殖的影响（J）。

结合蛋白：

（2）CircNfix与Ybx1结合并促进其降解：circNfix和对照组的蛋白质谱分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或阴性IgG抗体进行RIP实验（云序生物提供该服务）（B）。P0 CMs中过表达circNfix后Ybx1蛋白表达水平（C-D）。qRT-PCR检测P0 CMs中Ybx1 mRNA表达水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中过表达和不表达circNfix时， circNfix和Ybx1的亚细胞共定位（F）。分馏实验表明，circNfix过表达促进了Ybx1在细胞质中的易位，增加了Ybx1在细胞质中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干扰后，细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供该服务）检测显示，cyclin A2和cyclin B1启动子中Ybx1结合位点扩增（I）。细胞裂解物用抗Ybx1抗体免疫沉淀，用泛素(Ub)特异性抗体、抗Ybx1抗体或抗nedd4l抗体免疫印迹分析进行WB分析。过表达circNfix的CMs中Ybx1蛋白表达水平（K-L）。

ceRNA机制：

（3）circNfix与miR-214的相互作用：预测miR-214和miR-761能够与circNfix结合（A）。成年小鼠心脏中下调circNfix后，miR-214和miR-761的表达（B）。双荧光报告实验检测miR-214和circNfix能够直接结合（C）。RNA pull-down（云序生物提供该服务）实验检测circNfix能够拉下miR-214（D）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和circNfix能够共定位在胞质中（E）。RNA FISH实验检测P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能够共定位在胞质中（F）。双荧光报告实验检测miR-214和Gsk3β 3’UTR直接结合（G）。WB检测干扰circNfix后Gsk3β蛋白的表达水平（H）。WB检测干扰或过表达miR-124后Gsk3β蛋白的表达水平（I）。WB检测干扰circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表达水平（J）。CMs中，干扰circNfix后β-catenin的表达水平（K）。CMs中，干扰Meis1后Meis1和 Gsk3β的表达水平（L）。CMs中，干扰Meis1和circNfix后GSK3β的表达水平（M）。干扰circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs进行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。