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    周细胞-内皮细胞的串扰-环状RNAcPWWP2A在糖尿病性视网膜病变中的重要作用


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    circRNA-131

    转自：两个小齿轮（微信公众号）

     

    糖尿病是一类以血糖升高为特征的代谢性疾病。长期的高血糖危害全身微血管组织，从而导致了糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变，和糖尿病足等一系列并发症。糖尿病视网膜病变的特征以周细胞丢失、基底膜增厚、血管渗透性增加、血管闭塞和微血管瘤等。视网膜血管细胞主要包括周细胞和内皮细胞。周细胞和内皮细胞的正常串扰对视网膜血管发育和稳态起着至关重要的作用。然而高血糖破坏了这两类细胞的正常串扰，从而导致了严重视网膜血管损伤。那么我们可不可干预这个过程，从而保护、避免血糖引起的血管损伤呢？ 

    来自上海复旦大学附属眼耳鼻喉医院的赵晨团队和严彪团队于2019年4月9号合作发表在PNAS上的“Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction”。该论文从环状RNA（Circular RNAs）的角度回答了这一问题。

     

    为了解糖网病中各种circRNAs的表达，研究者进行了circRNAs微整列表达谱分析，在844种circRNAs中发现433种上调，411下调，随机选取了20种上调和20种下调的circRNAs进行分群聚类分析，通过与人类基因库比对，选定cPWWP2A，再通过Sanger测序验证，且不可被RNA酶降解，进一步明确其为circRNA。qPCR的结果也表明糖尿病小鼠和病人的cPWWP2A均上调明显（图1）。

     

    图一
    通过注射cPWW2A shRNA，抑制视网膜中cPWW2A表达，而不影响cPWW2A mRNA表达。免疫荧光染色显示cPWW2A沉默后视网膜血管中周细胞的分布减少。而周细胞减少引起网膜血管渗透性增加。伊文氏蓝染色也显示糖尿病小鼠的视网膜血管渗漏加剧。蛋白酶消化视网膜血管铺片进一步显示cPWW2A沉默后周细胞丢失，无细胞性血管和微动脉瘤均增多。与此同时，ELISA的结果也表明cPWW2A沉默后，IL-2，IL-6，TNF-α, VEGF, and MCP-1的表达也就明显增加（图2）。

    图二
     碘化丙啶（PI）染色和蛋白酶3/7活性检测显示cPWW2A沉默后加重了高血糖诱导的周细胞凋亡。增殖性糖尿病视网膜病变血管增生能力通常破坏网膜血管增生。cPWW2A沉默后导致周细胞标记物下调，包括PDGF-β, α-SMA, Desmin,和NG2。Ki67染色结果显示周细胞增生减少。在人周细胞和视网膜血管内皮细胞（HRVECs）共培养时，发现cPWW2A沉默后减少了向HRVECs募集的周细胞。周细胞中的cPWW2A沉默后内皮细胞的渗透性显著增加（图3）。
    图三
    RNA-FISH检测表明cPWW2A 主要表达于周细胞的细胞质。研究者推测cPWW2A可能是作为miRNA海绵调控基因表达。Ago2蛋白是RNA诱导沉默复合物（RISC）的核心部分，以mRNA为靶点，结合miRNA复合体。RNA免疫沉淀法中，Ago2抗体可特异性结合内源性cPWWP2A，而非IgG。整个cPWWP2A序列被插入到pGL3荧光素酶reporter，形成LUC-cPWWP2A 载体。通过TargetScan算法找寻cPWWP2A的干扰RNA为miR-579。荧光素酶活性筛选显示miR-579模拟物转染后，显著降低LUC-cPWWP2A活性。RNA-FISH法显示cPWWP2A 和miR-579 在周细胞上是共定位表达，结合点见图4。
    图四
    接下来，为进一步确定miR-579的靶点基因，三个候选基因分别是angiopoietin 1/occludin/SIRT1，miR-579的过表达降低所有候选基因的荧光素酶活性。同时cPWWP2A 沉默后，也显著降低了这三个候选基因的表达。为进一步检测miR-579在体外周细胞和周细胞-内皮细胞串扰的影响，研究者又进行了以下实验。上调miR-579后，周细胞凋亡增加，周细胞标记物PDGF-β, α-SMA, Desmin, 和NG2均表达下降，此外，周细胞增生减少，且周细胞募集也减少。而与之相反，过表达cPWWP2A，可部分逆转miR-579介导的对周细胞的影响。（图5）

    图五
    进一步明确体内miR-579对视网膜血管失调的影响，研究者实验发现，与cPWWP2A 沉默后结果一致，miR-579激动剂注射后，小鼠视网膜中angiopoietin 1,occludin, and SIRT1 表达下调。同时，视网膜血管中周细胞覆盖减少。视网膜血管铺片显示糖尿病视网膜中无细胞毛细血管，鬼影周细胞和微血管瘤的数量均增加了，而且注射后，血管渗漏也加重了（图6）。
    图六
    从糖尿病和非糖尿病视网膜中分离出原代周细胞和内皮细胞。糖尿病视网膜中周细胞和内皮细胞的cPWWP2A的表达均显著增高。而高糖诱导的体外细胞实验发现，只有原代周细胞的cPWWP2A表达上调，而内皮细胞不受影响。上述结果表明cPWWP2A似乎是通过旁分泌的方式，而不是有内皮细胞直接分泌。原位杂交和荧光染色显示对照组视网膜中cPWWP2A主要表达于周细胞上和在内皮细胞周围。糖尿病引起NG2信号显著下调，表明了周细胞丢失，而在糖尿病视网膜组， cPWWP2A高度表达在内皮细胞上。通过GW4869抑制外泌体的分泌，减少了cPWWP2A从周细胞到内皮细胞的转运，表明了cPWWP2A不是凋亡细胞里释放，而是从外泌体分泌的。为了进一步验证这点，利用CRISPR/Cas9系统，特异性敲除内皮细胞的cPWWP2A，使内皮细胞自身不能表达cPWWP2A。高糖诱导周细胞培养基可以增强cPWWP2A-/- 内皮细胞的增生、移行和管腔形成能力。相反地，如果加入cPWWP2A反义转录物能抑制上述现象（图7）。
    图七
    综上所述，此研究揭示了糖尿病性微血管异常的机制，主要涉及周细胞上cPWWP2A、miR-579和angiopoietin 1/occludin/SIRT1的相互调控，及其通过外泌体转运cPWWP2A至内皮细胞，而对内皮细胞产生的影响。

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