转自： 康成生物资讯（微信公众号）

今天小编为各位解析题为“Extensive translation of circular RNAs driven by N⁶-methyladenosine”的文章，通讯作者为中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授。文章报道了，人细胞中的m6A修饰——这一RNA中丰度最高的碱基修饰，能有效地起始circRNA的蛋白翻译。作者发现，circRNA上有公认的m6A motif富集，而一个m6A位点就足够启动翻译的起始。这个m6A启动的翻译需要起始因子eIF4G2和m6A识别蛋白YTHDF3，同时能被甲基转移酶METTL3/14加强，能被去甲基化酶FTO抑制，也能被热激上调。通过polysome profiling、电脑预测以及质谱实验发现，m6A驱动的circRNA翻译是广泛存在的，有数百个内源的circRNA都有翻译潜能。作者的研究，拓宽了人类转录组的研究，同时也提示了一种circRNA来源的蛋白在应对环境压力中的角色。

Introduction

目前关于circRNA的研究，主要报道其能作为诱饵吸附miRNA(比如miRNA海绵)或结合和隔离一些RNA结合蛋白，然而大部分的circRNA的生物学功能仍然未知。一个很有趣的可能是，circRNA能翻译蛋白，因为绝大部分的circRNA是由外显子构成的，且circRNA主要分布在细胞质中。事实上，含有内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site, IRES）的人工circRNA在体外或体内都可以翻译。然而circRNA的编码潜能仍然是个开放的问题，因为很早前的报道中提到，绝大部分的circRNA与多核糖体没有什么关联。

m6A是真核生物中丰度最高的RNA修饰。这个修饰偏向于发生在一个公认的motif基序“RRm6ACH”(R=G或A；H=A, C或U)，通过MeRIP Seq，共在人和小鼠中发现了超过7000个mRNA和300个非编码RNA有m6A修饰。腺嘌呤（A）的甲基化是由METTL3\METTL14和Wilms’肿瘤1相关蛋白构成的甲基转移酶复合体催化形成。m6A的去甲基化可由FTO(fat mass and obesity-associated protein)和AKLBH5(alkylated DNA repair protein alkB homolog 5)催化。细胞中，m6A能被YTH结构域家族蛋白YTHDF1,2和3识别和结合，他们即是m6A的识别蛋白。m6A修饰能影响多个阶段的RNA代谢，包括mRNA定位、剪接、翻译和降解，反过来调控重要的生物学过程比如干细胞分化。特别地，m6A对翻译有多方面的影响：3‘ UTR上的m6A能通过被YTHDF1结合后，能提高翻译效率，然而5‘ UTR上的m6A通过YTHDF2蛋白机制促进热激作用下的帽子非依赖翻译。此外，近期有报道称YTHDF3通过与YTHDF1协同作用促进蛋白合成，而胞质中的YTHDF3与核糖体蛋白相互作用促进mRNA翻译也进一步支持前面的发现。然而，m6A对mRNA翻译的一般作用仍然是个不完整的故事，细节的机制仍然未知。

本文报道人细胞中的circRNA通过一段含有m6A位点的短序列作为IRES而有限地翻译。FTO能减少circRNA的翻译，甲基转移酶METTL3/14能促进翻译，同时需要真核生物翻译起始因子eIF4G2和m6A识别蛋白YTHDF3。

Results

有m6A motif的circRNA能在细胞内翻译

早前，作者构建了一个minigene报告基因，包含有split GFP来证明用病毒IRES 能启动circRNA的翻译（下图A）。作者插入了人基因组中几种内源IRES或对照序列的circRNA，检测是否也能翻译。令人惊讶的是，所有插入序列，包括3个38-253nt的阴性对照，都能有效地起始GFP翻译（下图B）。

让作者很疑惑的是为什么插入阴性对照也能诱导circRNA翻译，作者研究了翻译起始位点附近的序列。结果发现，所有的阴性对照都在起始密码子附近含有一个RRACH motif，使其带上m6A修饰（下图左）。因为m6A被报道能提高mRNA翻译的效率，作者猜测含有m6A的RRACH序列或许参与了circRNA翻译的起始。为了验证这个假设，作者在circRNA报道基因起始密码子的前面插入了一小段含有不同拷贝数的m6A motif序列，同时检测在转染的293细胞中GFP蛋白的产量。与预期相符，含有1个或2个m6A motif的circRNA就能有限地翻译出GFP蛋白，而含有突变motif的细胞中，产量则显著减少（下图右）。此外，含2个m6A motif序列的circRNA与含1个motif序列的circRNA相比，其翻译效率相似，说明独立的一个m6A位点就足够起始翻译了。当插入任何不含腺嘌呤（A）的序列后，circRNA的翻译都消失。除此之外，作者试验了两个被报道能发生m6A修饰的序列，RSV和RSVns，结果发现这两个序列也能强烈地诱导circRNA翻译。重要地是，降低m6A甲基化的序列同时能降低翻译效率，也更加证明了m6A驱动了circRNA的翻译。

作者在Hela细胞中的研究也发现了circRNA的翻译，这意味着m6A起始的circRNA翻译是不受细胞类型限制。但是，在Hela细胞中，即使是突变的m6A motif，也仍然有一些GFP蛋白的表达。这或许是因为m6A发生在了非经典的位点或者是在Hela细胞中其他一些序列可以起始m6A依赖的circRNA翻译。

调控circRNA的m6A水平影响翻译效率

为了进一步研究m6A对于circRNA翻译的重要作用，作者通过RNA-IP检测含有m6A motif的circRNA是否真的被甲基化了。结果显示，识别m6A位点的抗体特异性地富集到了含有RSV m6A位点的circRNA以及一个已知的含有m6A修饰的mRNA(SON mRNA)，没有富集到未含有m6A的对照mRNA。含有突变m6A位点的circRNA（RSV-mut）也同样被富集到了，但含量非常低。这个研究表明，突变能降低RSV上的m6A修饰但不能完全去除该修饰，这与插入RSV-mut 报告基因的circRNA中有少量GFP表达的结果一致。亦或者，在circRNA中还有其他小的m6A位点。此外，共表达m6A去甲基化酶FTO能显著减少免疫沉淀的SON mRNA或含有RSV的circRNA的富集水平，也能降低从circRNA上翻译GFP（下图A&B），进一步确认circRNA/mRNA的m6A位点的确发生了甲基化，同时circRNA的翻译的确是m6A起始的。与这些发现一致的是，共表达甲基转移酶METTL3/14能显著增加含有m6A位点的circRNA或mRNA的RNA RIP信号，且能显著增加circRNA的蛋白翻译（下图C&D）。

m6A甲基化在热击压力下会影响mRNA的翻译。参考了这个思路，作者在42℃ 1h处理后又恢复到37℃的细胞中发现了含有m6A的circRNA翻译的蛋白量上升，而GFP circRNA的水平并未发生变化（下图）。这个发现表明，m6A介导的蛋白翻译，尤其是从circRNA的翻译，或许是细胞应激反应的一个重要参与者。一个可能的机制是，在热击作用下胞质中的YTHDF2转位至细胞核内，封闭了m6A去甲基化酶FTO，增加了circRNA上的m6A修饰水平，进而增强了circRNA的翻译。亦或者，热击压力广泛地减少了帽子依赖的翻译，引起细胞都转向了通过IRES的非帽子依赖的翻译，因此circRNA非帽子依赖的翻译也就相应增加了。

m6A起始的circRNA翻译需要蛋白因子的参与

circRNA翻译需要通过一种和线性RNA翻译完全不一样的机制。真核生物的翻译是eIF4复合体起始的，eIF4E与mRNA的帽子结合，同时eIF4G作为蛋白结合支架组装起始复合体。紧接着，激活的40S 核糖体亚基在eIF3结合eIFG4后被招募至mRNA处（下图A左）。在帽子非依赖的翻译中，在eIF4E不存在的情况下，一个非典型的eIF4G蛋白（eIF4G2）直接识别一个IRES并起始eIF4复合体组件，引起翻译的起始（下图A右）。为了深入理解m6A驱动的circRNA翻译，作者研究了circRNA翻译起始中eIF4G2的参与。用两个稳定的表达有eIF4G2 shRNAs的细胞株（下图B），作者检测了circRNA或者mRNA编码的GFP的表达。与预期相符，eIF4G2缺失显著降低了circRNA的蛋白翻译，但是并未影响线性mRNA的翻译（下图C）。相似地，eIF2A，一个eIF3的亚基与病毒IRES结合，适宜地降低了circRNA的翻译，但是并未影响线性mRNA的翻译（下图D&E）。最后综合各种结果，作者得出结论，circRNA的翻译是通过一个依赖于eIF4G2的机制。

接下来，作者研究了含有m6A的circRNA的翻译是否需要m6A识别蛋白。作者发现，RNAi处理后的YTFDF1的缺失不会影响circRNA的翻译，而YTHDF2的缺失会轻微地抑制线性RNA和circRNA的GFP翻译。然而，YTHDF3的缺失则显著抑制了circRNA的GFP翻译，但不影响线性RNA的翻译，这提示说YTHDF3对于m6A驱动的circRNA翻译是必须的。与此一致的是，免疫共沉淀结果显示，YTHDF3能直接与eIF4G2相互作用，提示YTHDF3可能在招募eIF4G2至含有m6A的RNA中扮演一定的角色。

此外，作者通过基因组分析多种起始因子的结合位点、,转录组范围内的m6A检测、翻译起始位点（TIS）比对等方法来研究体内circRNA分子的可能翻译情况。研究表明，eIF4G2和eIF3A倾向于结合在有m6A和TIS的circRNA，这与前面发现这些因子可以促进circRNA翻译相一致。与预期一致，eIF4G2的结合位点经常与预测到的TIS附件的m6A修饰相重合（下图）。

鉴定内源的含有m6A修饰的circRNA

通过m6A IP结合高通量测序的方法，作者共鉴定到85个含有m6A修饰的circRNA。根据m6A IP vs 总input中circRNA reads的分布，作者预测13%的circRNA有m6A修饰。鉴于作者的实验设计和分析过于严格，这个数据或许是个保守的估计，因为作者的实验只有一部分含有m6A位点的被IP富集到，且只有back-splice junction附近的m6A位点才被认为是circRNA reads。尽管如此，这些数据仍能说明，circRNA存在着大量的m6A甲基化修饰。

人转录组中普遍存在着有编码潜能的circRNA

根据以上的研究，作者开发了一个流程，通过一系列过滤设置，预测内源性的有翻译潜能的circRNA。以从Hs68细胞的RNase R处理后的RNA seq中得到的7771个circRNA作为起始，作者首先鉴定了623含有m6A peak的circRNA，又进一步通过pre-mapped TIS的过滤设置，将候选者缩小至124个circRNA。最后挑选了25个有足够长ORF（≥150nt或编码超过50个aa的蛋白）的circRNA。进一步通过多核糖体检测把从25个circRNA中挑选的12个进行试验验证，发现其中有10个的确与多核糖体相关。作者认为这些通过严格过滤的25个circRNA只代表了培养细胞中有翻译潜能的circRNA的一小部分。深入地研究还会增加有翻译潜能circRNA检测的灵敏度。

作者又通过实验去寻找人转录组中正在进行活跃翻译的circRNA。作者首先用蔗糖梯度离心的方法纯化多核糖体相关的RNAs，紧接着用RNase R处理纯化得到的RNA，然后进行高通量测序。测序reads比对到人基因祖上，用CIRCexplorer鉴定back-splice junction。作者发现有250个circRNA与多核糖体有作用。前面预测到的25个circRNA中，只有一个在polysome profiling/circRNA中找到。提示作者的方法，并没有饱和。

作者进一步用RT-PCR研究了单核糖体和多核糖体相关的circRNA，并且确认，7个试验的circRNA都与核糖体相关，其中5个与核糖体结合的碱基数目比没结合的碱基数目要多。对于一些circRNA，很长的片段都与核糖体相关，提示这些circRNA在活跃的翻译中。用能特异性干扰活跃翻译核糖体的腺嘌呤素处理，发现与多核糖体相关的circRNA显著减少，提示与多核糖体相关的circRNA就是因为活跃的翻译。综合以上，作者的研究表明，人转录组普遍存在着有编码潜能的含m6A的circRNA。

CircRNA junction上翻译的内源性肽段

为了直接鉴定由circRNA编码的内源性蛋白，作者开发了一个包含跨越所有已知circRNA back-splice junction序列所编码的肽段的数据库，将之与人蛋白数据库UniProt联合，检测293细胞裂解物的MS/MS结果。

作者鉴定到了33个circRNA back-splice junction编码的肽段，它们不与UniProt数据库中任何蛋白匹配。MS/MS质谱展示两个代表样品结果。为了进一步验证候选的circRNA编码的肽段，作者化学合成了其中两条circRNA编码的肽段，并且用这两个肽段做了MS/MS。这两个化学合成的肽段的MS/MS结果与细胞裂解物中原始肽段的MS/MS结果近似匹配，提示蛋白组学分析发现的肽段很可能是circRNA翻译产生的。

Discuss

circRNA有大量的m6A修饰，足够去驱动一种由m6A识别蛋白YTHDF3和翻译起始因子eIF4G2参与的非帽子依赖的蛋白翻译（下图）。同时，很多circRNA被发现是与多核糖体相关的，提示有相当数量的内源性circRNA是翻译的。circRNA-m6A-seq仍能告诉我们m6A修饰在circRNA中很普遍的，提示我们，在人的转录组中，可翻译的circRNA是普遍存在的。这个结果挑战了把circRNA当做非编码RNA的刻板观点，同时也开启了circRNA潜在功能的新研究方向。

这些发现同时引出一些很有趣的问题，比如，circRNA编码蛋白可能的功能是什么。作者发现在热激条件下，circRNA的翻译是增加的，增加了circRNA编码蛋白在压力反应中扮演一定角色的可能性。有报道说，在癌症中，非帽子依赖的通过IRES进行的翻译是上升的，以促进基因的翻译。这一机制在细胞应激反应、发展、凋亡及细胞周期调控中发挥重要作用。因为circRNA是能通过非帽子依赖的途径进行翻译，因此作者推测circRNA的翻译在癌细胞中可能很流行，当然这依然是个待确定的问题。此外，很多circRNA编码N终端蛋白片段，能产生与传统翻译蛋白有重叠序列的蛋白异构体。结果，有可能circRNA编码的蛋白异构体干扰相对经典的蛋白的功能。同时，作者也发现一些短的没有公认m6A motif序列也可以驱动circRNA的翻译，意味着circRNA翻译也可被一些非m6A依赖的机制驱动，或者是腺嘌呤的甲基化也可在非经典位点发生。

此前一些非编码RNA被报道有5’ORF编码的潜能，然而体内的m6A驱动的非帽子依赖的翻译提示了另外一种更有说服力的非编码RNA从内部ORF开始的翻译。因此，一个细胞的翻译图谱可能会对我们目前认为的更加复杂。就如一个基因可以通过可变剪接产生多个mRNA异构体一样，作者推测非帽子依赖的翻译也可使一个mRNA被翻译成多个不同的蛋白。