circular RNA（circRNA）预测软件对比，circRNA的预测对于后期研究意义重大，怎么利用现有的工具去减少后期的 工作量并比提供研究中的效率显得非常重要，同时能减少成本和精力的投入，今天针对find circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA finder和CIRI 五个软件进行了对比，找出了各个软件的优劣。

先看几个软件的特点：

所以可以根据软件特点选择合适的软件进行应用

在网上搜到了其中三个软件的中文介绍：（为copy and paste）

"1. find_circ

这款工具是在2013年随着 Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency 这篇文章发布的，从而吹起了一阵研究circRNA的风潮～。

现有的所有circRNA工具的第一步都是mapping，将RNA reads mapping到基因组上，但是普通线性RNA是可以很好的mapping回去的，对于circRNA来说，成环的剪接位点不能直接mapping回基因组上。 首先，就是用比对mapping的方法筛选出这样的序列，也就是把mapping不上的序列都体取出来。 然后，将这些mapping不上的reads取两头20bp，变成短序列，重新mapping到基因组上。

这里有个参数20bp的reads，为什么要用20bp的？是否可以用更长的，或者更短的？

我们来做个简单计算。多长的一条序列可以唯一比对到基因组的某个地方？ 首先，基因组的大小为3G，也就是 三十亿字节 。

，约为 十亿字节 。 那么任意取出一条15bp的read，它的碱基排列情况是4^15的其中一种，任意取出两条15bp的reads 它们完全相同的概率为。 从基因组上的任意取出15bp长的一段序列，有三十亿种可能性，取两次， 取出同一条15bp长的序列的可能性为， 这种可能性(概率)小于 任意从15bp序列的全部碱基排列情况中抽出2次相同碱基序列的概率 ，所以说15bp的read可以不唯一比对到基因组的某个地方。 同理计算16bp reads，所以任意抽出一条16bp的序列可以唯一比对到基因组上。（可能算得不对，如果有人发现错误，请立即指正，谢谢）

这样看来20bp的序列，可以唯一比对到基因组上，也可以根据测序reads的长度适当放大缩小（我觉得缩小还是没必要的，可以放大，取25bp，30bp之类的）。

接下来，将短序列mapping到基因组上后，他们开发了一个方法，检测这些短序列是否是circRNA的短序列。

需要检测的条件如下：

GU/AG 在剪接位点的两侧出现

可以检测到清晰的breakpoint

只支持2个mismatch

breakpoint不能再短序列（anchor）以里2 nucleotides 之外的地方出现，也就是最多2nt （这条可能理解有偏差）

至少有两条reads支持这个junction

mapping正确的一个短序列的位置要比它mapping到其他位置的分值高35分以上。

通过这些条件，就筛选出了文章认为正确的circRNA。

另外在这篇文章里重点介绍了circRNA的一个功能，富集microRNA，某些circRNA上有很多microRNA的seed。

2. CIRCexplorer

这款工具是在2014年随着 Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 的发布而问世，这篇文章我非常欣赏，我认为它是去年做RNA领域最值得读的一篇文章。

CIRCexplorer这个工具巧妙的用fusion gene这个思路去检测circRNA。 首先，过滤出Tophat无法mapping上的reads，再把这些reads用Tophat-Fusion mapping到基因组上。那些用Tophat-Fusion mapping到基因组上的非线性候选位置的reads就是潜在的back-splied juction reads。 接下来，这些reads会在有基因注释的帮助下，确定更加精确的donor, acceptor位置。 最后，对circular RNA进行注释。

这篇文章里介绍了在intron区域的 反向重复Alu序列 是引起circRNA形成的一个原因（即“内含子配对驱动环化”（intron-pair-driven circularization）模型，除此之外还有一种模型是“套索驱动环化”（lariat-driven circularization）模型），这些序列在跨越外显子的内含子区间上可以形成互补序列，所以在转录过程中容易形成茎环结构。环的部分就是外显子，然后在剪接酶的参与下，被剪接成了环形。

另外，cricRNA也存在很多的 可变环形结构 ，这也是由于在基因组中广泛存在的内含子上的Alu序列造成的，不同的Alu序列互补，形成含有不同exon的环形结构。

3. CIRI

这款工具是中科院北京生命科学研究院的赵老师组的工作，今年发表在genome biology上， CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification，是一篇方法工具类的文章。

文章中总结了目前从RNA-seq数据中识别circRNA所遇到的问题：

circRNA比其他RNA在细胞中的比例低，一般RNA-seq的实验步骤中，不包括circRNA富集的步骤（例如RNase R treatment，我觉得他们要表到的意思是在RNA-seq中能探测到的circRNA比用RNase R处理过的数据中少），所以在RNA-seq中的circRNA比较低，假阳性也高。

目前的注释文件都是根据线性RNA进行的，所以也不适合circRNA的识别，另外非模式动物的注释信息更少，就更不用谈在那些物种里找circRNA了。

由于RNA测序数据的reads长度差别大，也对检测circRNA工作带来了不便

套索结构和融合基因同circRNA的reads结果类似，不好区分。

文章中总结了从2012年到2014年出现的几种检测circRNA的方法：

Salzman Cell-type specific features of circular RNA expression 用了一个依赖注释信息的方法来检测circRNA，通过搜索已知注释的外显子边界来查找，并在最近的工作中更新了方法，加入了false discovery rate 控制比对的质量分数。这种方法存在上述描述的第二个问题。

Memczak Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency（也就是第一部分介绍的那个软件）用了GT-AG信号来找寻splicing 位点，也有其他工作用类似的方法筛选micorRNA-sponge 的候选circRNA。这种方法会找不到“长外显子1-短外显子-长外显子2”形成的环形结构，这种结构中一条测序Read上会有三个部分，第一部分序列属于长外显子1，第二部分序列属于短外显子，第三部分序列属于长外显子2。 Memczak的方法只是把一条序列切成两部分，这种算法会把“长外显子1-短外显子-长外显子2”丢掉，或者识别成“长外显子1-长外显子2”。

Jeck Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats 采用了比较的方法，比较没有经过RNase处理和经过RNase处理的序列的结果，用来确定潜在的circRNA，消除假阳性。这种方法在富集circRNA阶段会有系统误差。

说了那么多其他人的工作，赵老师组的工作是采用sam格式中的CIGAR值进行分析的，从sam文件中扫描PCC信号（paired chiastic clipping signals）。 CIGAR值在junction read的特征是xS/HyM或者xMyS/H，其中x,y代表碱基数目，M是mapping上的，S是soft clipping，H是hard clipping。

对于单外显子成环，或者“长外显子1-短外显子-长外显子2”形成的环形结构，CIGAR值应该是xS/HyMzS/H以及(x+y)S/HzM或者xM(y+z)S/H，CIRI软件可以很好的将这两种情况分开。

对于paired-end reads，CIRI算法会考虑一对reads，其中一条可以mapping到circRNA上，另一条也需要mapping到circRNA的区间内。

对于splicing 信号(GT,AG) CIRI也会考虑其他弱splicing 信息例如（AT-AC），算法会从GTF/GFF文件中抽取外显子边界位置，并用已知的边界来过滤假阳性。

CIRI方法消耗的内存比较大，我跑了个12G的sam文件，内存用了20G。

方法比较

从一开始的biostar链接中就可以看到不同方法的差异非常大，我测试了一个实际数据，从第一个软件有126163行结果，第二个软件只有327行，第三个软件有687行。"

（以上“”内为网页引用文字）

再回到软件对比介绍

然后看看对比情况：

从这个结果可以发现，各个软件都有自己的运用方法，而且都不同，但是可以找到一些交集，可以看上面的维恩图。所以这也是采用多个软件取交集的原因，会提高可信度。

各个软件具体优劣：

最后是联合应用软件预测效果：

研究者发现：combining any two algorithms would greatly decrease the false positive rate and in general strengthen the output quality.

文章引用之丁香园论坛

文献下载|downloadComparison of circular RNA prediction tools