转自：生信菜鸟团（微信公众号）

前情提要

又是一篇CELL大作，首先简单回顾一下19年 circRNA 报道的大事件（CELL合集）

1. 2019年2月7日 (农历己亥年正月初三) 首篇文章报道了癌症中 circRNA 的研究工作，研究通过比较报道一种能够更完整展示 circRNA 数据的测序方法 [ exome capture sequencing ] ，该方法能够精确且无偏好地评估RNA丰度，转录本覆盖度。构建文库所需的总RNA起始浓度为 0.1-3ug (100ng 样本需要提高PCR循环数)。同时构建了迄今为止最全面的、以肿瘤组织 circRNA 数据目录 MiOncoCirc，网址如下：https://mioncocirc.github.io，之后的几期推文都有应用该数据库，可戳。
2. 第二篇同样发表于2019年2月7日，作者采用大队列样本（144列前列腺肿瘤样本）进行非poly-A 富集 RNA-seq 分析，结合与线性转录本的分析及丰富的长期临床随访记录，并引入 CRI 计算 circRNA 是否具有高度表达，通过大量的 shRNA 筛选实验以及 KO/OE 回复实验，证实前列腺癌中 circRNA 能够独立的发挥稳定功能，暗示其具有独特的预后信息可用于临床。
3. 第三篇报道了一个七种脊椎动物 circRNA 的综合数据库 circAtlas 2.0，涵盖各样组织 由  CIRI2,  DCC,  find_circ, CIRCexplorer2 ，并进行统计。circAtlas 2.0 提供不同数据库的 circRNA ID 转换，预测潜在的多肽编码 circRNA (例如：ORF, IRES)，预测 circRNA 调控元件 (例如：miRNA，RBP)、保守性分析及疾病关联分析。地址：http://circatlas.biols.ac.cn/ 。
4. circRNA 不仅能够在肿瘤发生、心血管中发挥重要的功能，除了吸附 miRNA 发挥内源性竞争RNA 的作用，circRNA 还能够识别、转运及储存蛋白参与调控，甚至在特定的条件下能够启动翻译。4月25日 报道了一篇 circRNA 在先天免疫反应中发挥的功能。在研究中，作者发现，较线性 RNA circRNA在结构上更稳定的，且包含 dsRNA 的 circRNA能够结合 PKR 在免疫过程中发挥关键功能。最后通过系统性红斑狼疮样本佐证上述研究，并留下伏笔：外周血细胞群中T细胞的circRNA过表达能够同样调节PKR，那么是否这些底物的变化是否也能作为一个预前指标，提前干预呢？

编者按

几乎是一月一推的，5月29日 CELL Resources 报道了circRNA 在人类心脏翻译的研究进展。

circRNA 翻译研究方法及背景点下面的链接可以快速获得 ：）

circRNA 在条件下翻译的几种模式及小工具推荐

今天推送我们来看一个高级案例：

知识累积

翻译与翻译组

翻译是中心法则中最后一步也是实现功能关键一步，ORFs 可能受到多个调控，例如上游的ORFs （uORFs）可能抑止 mRNA 的翻译效率；或者由长链非编码RNA翻译获得的 短ORFs （sORFs）可能介导微蛋白的产生，已有多篇文献报道了这类微蛋白具有关键的生理作用。

如果用测序手段获得表达谱，首要使用的多为转录组，但是转录组主要的针对于mRNA进行测序，只能获得进入翻译阶段的基因，但是无法获得更多的信息，例如翻译效率以及蛋白质高级结构等。

翻译组即是一种能够获得高通量、检测瞬时翻译强度和密码子翻译进程的组学手段。根据实验方法不同能够分为多核糖体测序（RNC-seq）和核糖体印记测序（Ribo-seq）。多核糖体测序主要依赖的实验方法是 [蔗糖密度梯度离心] ，由于 mRNA 上可能会结合不同数量的核糖体，因此正在翻译的 mRNA 由于不同分子量便在该体系中分层，从而区分得到正在翻译的 mRNA。相较于 RNC-seq，核糖体印记测序在实验端能够固定、富集、分离被核糖体大小亚基保护的mRNA片段，也就是说 Ribo-seq 能够获得正在翻译的位置、定位 ORFs及捕捉翻译速率的变化。两者之间侧重点、精度不同，对应的实验难度也不一样。

扩张型心肌病（DCM）

是常见的心脏移植的主要原因。

图片来源于wiki

主要结果及分析

数据分析

为了研究 DCM 心脏 mRNA 表达和翻译，作者采用 mRNA-seq 和 Ribo-seq 联合分析的手段（实验流程图见图1A），对 65 名晚期 DCM 患者和 15 名 非DCM 人群的人左心室心脏组织进行分析。总共获得 22,335个 ORFs，其中 1,090个 uORFs 来源于919个基因（图1D），339个 sORFs 来源于在 169个预测的 lncRNA 的非重复序列（图1E）。图1F显示，较先前报道的蛋白质组，翻译组分析获得了两倍以上的基因产物，这可能是由于低表达的蛋白在 MS 检测中被忽略了。根据以上的心脏翻译事件结果，作者构建了一个搜索数据库方便大家获得数据。地址链接：http://shiny.mdc-berlin.de/cardiac-translatome/。

差异比较

为了鉴定翻译过程中被特异性调控的部分，这里引用了互作模型 (Chothani et al., 2017)，获得了327个翻译下调基因和474个翻译上调基因。随后，作者关联所有样本中的差异基因和翻译水平，并结合 GO富集分类进行聚类，总共获得30个共同调节基因簇，其中22个富集了不同的细胞过程（图2A）。通过主成分分析发现，细胞外基质（ECM）的特异性翻译上调（图2B和2C），可能导致心脏损伤和衰竭的标志性纤维化反应。此外，在转录水平和翻译水平显著上升的过程中，线粒体过程下调可能是心力衰竭和能量缺乏的表现。

翻译调控因素分析

比较919个基因中的1090个处于翻译阶段的 uORFs与原始ORF的翻译速度的关系，发现上游ORFs对翻译效率的影响与翻译率无关。对比大鼠和小鼠心脏的翻译过程，其中有281个人类 uORFs 高度保守性，但是这些对 ORF的 TE过程并无更强的作用。

根据先前的研究显示，蛋白质截短变体（PTVs），包括能够导致DCM的titin截短变体（TTNtv）通常无法有效终止翻译，但是在本研究中，并非所有的TTNtv都能有效的终止翻译，并且这些翻译模式的比例具有个体差异。

sORF分析

虽然在人类的心脏、肝脏和肾脏中，sORFs广泛表达，但是经常被人们所忽视，因此其在调控方面的功能存在着大量空白。根据来源能够简单分为lncRNA翻译及circRNA翻译来源。

本研究中，作者发现783个转录的lncRNA中，169个（22%）具有翻译潜在微蛋白的能力，这些蛋白氨基酸长度的中位数为49（图4A）。为了验证这些sORF的翻译潜力，作者对随机挑选了58个人类lncRNA的完整转录本进行体外翻译（IVT）测定，发现产生了44个微蛋白，且这些lncRNA至少能够在10个组织中表达。

人类心脏circRNA的翻译除了lncRNA之外，circRNA是另一类具有翻译潜力的非编码RNA。首先作者在3,181个基因中检测到8,878个人心脏circRNA，其中2,070个为新报道的circRNA。值得注意的是，基于核糖体结合，在39个基因中发现40个circRNA具有蛋白质翻译潜力。并使用shutgun 质谱方式证明其中6个circRNA的翻译产物。

这些新检测到的核糖体相关的circRNA，包括明星分子 circCFLAR（图7D）和心脏特异性circRNAs circLC8A1（图7E），circMYBPC3和circRYR2。

circRNA筛选条件

首先circRNA反向剪切位点需要 ≥ 9个碱基，在 Ribo-seq reads 中需要在3个独立样本中需要大于等于5个 spanning。

小结

文章的工作量非常大，结合核糖体印记的方法首次聚焦心脏中蛋白翻译情况，并验证到了一批由非编码RNA形成微蛋白。再次证实circRNA能够翻译。同时，提供了心脏 DCM过程中，蛋白翻译调控信息，这些微蛋白可能参与线粒体相关和其他细胞过程相关。

参考文献

van Heesch, Sebastiaan, et al. "The Translational Landscape of the Human Heart." Cell  (2019).