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本文原载于《中华临床感染病杂志》2017年第6期

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染所致的重要传染病之一，目前世界上大约有2.4亿慢性HBV感染者，其中20%～30%可能进展为肝硬化和/或肝癌^[1,2]。HBV是一种非细胞毒性病毒，其肝损伤主要是由于机体免疫应答所致，但具体机制尚未完全阐明^[3]。研究表明，微小RNA(miRNA)在调控机体免疫应答机制中发挥着重要作用，miRNA分子表达失调与慢性HBV感染的发生、发展密切相关^[4,5,6]。环状RNA(Circular RNA，CircRNA)是一种新近发现的非编码RNA，可调控miRNA的表达与功能^[7,8]。近期研究发现多个circRNA分子，如hsa_circ_0005968、hsa_circ_0005075等与原发性肝癌的发生发展密切相关^[9,10]。CircRNA是否在miRNA调控慢性HBV感染者免疫应答机制中发挥作用目前鲜见报道。为此，本研究拟采用新一代circRNA表达谱芯片，筛选CHB患者不同时期外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中异常表达的circRNA分子，应用生物信息学软件对其基因功能和信号途径进行分析，探讨circRNA分子在调控CHB患者免疫应答机制中的可能作用，为CHB治疗提供新的潜在的分子靶标。

1　对象与方法

1.1　研究对象

收集泰州市人民医院2014年10月至2015年10月住院和门诊收治的慢性HBV感染者7例，其中CHB患者4例，慢性HBV携带者3例。诊断按照中华医学会肝病学分会及感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》^[11]。排除标准：(1)接受核苷(酸)类抗病毒药物治疗，近6个月内应用干扰素-α(IFNα)和激素等药物治疗的患者；(2)合并其他肝病及有严重活动性疾病(心、脑、肾、高血压及糖尿病等)的患者、抗-HIV抗体阳性者、怀孕、酗酒及药物滥用者；(3)合并肝脏肿瘤者。健康对照组3名，来自健康体检者。所有研究对象的基线资料见表1。本研究方案经泰州市人民医院伦理委员会审批通过(201437)，所有入选者均签署知情同意书。

1.2　RNA提取与circRNA芯片检测

采集慢性HBV感染者和健康对照者的外周静脉抗凝血5 mL，密度梯度离心法分离制备PBMC，加入Trizol试剂(美国Invitrogen公司)1 mL，－80℃保存待测。(1)RNA抽提与定量：用Trizol试剂提取PBMC中的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，紫外分光光度仪检测吸光度(A)₂₆₀和A₂₈₀，计算RNA浓度。(2)circRNA芯片检测：采用circRNA Microarray Version 2.0(美国Arraystar公司)，按照芯片说明书进行操作。应用Rnase R去除线性RNA，富集circRNA。将富集的circRNA进行扩增，采用随机引物方法将其转录成荧光定量的cRNA探针，之后用RNeasy Mini Kit对标记的cRNA探针进行纯化。将标记好的探针和circRNA芯片进行杂交，Agilent杂交炉上孵育，65℃，17 h。洗涤、固定后，采用Agilent Scanner G2505C对杂交序列进行扫描。应用R软件包对原始数据进行分位数标准化和数据处理。两样本间使用倍数临界值来筛选；按照芯片厂家的标准将circRNA标准值之比≥1.5认为差异具有统计学意义。

1.3　实时荧光定量PCR检测芯片筛选的差异表达circRNA

逆转录合成cDNA，置冰浴待用。实时荧光定量PCR所用引物序列见表2，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应混合液：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L PCR特异引物正义链和反义链各0.5 μL，加水至总体积为8 μL。反应混合液加入384-PCR板，再各加对应的circRNA分子模板2 μL cDNA，短暂离心混合。将上述384孔PCR板置实时荧光定量PCR仪上进行反应。以β-actin为内参照，均按以下程序进行：95℃，10 min；40个循环(95℃，10 s；60℃，60 s)。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因校正后的相对含量。

1.4　CircRNA与miRNA相互作用的注释

应用基于靶基因数据库的miRNA靶预测软件分析(Arraystar公司，美国)分析circRNA与miRNA相互作用位点，对差异表达的circRNA与miRNA的相互作用信息进行详细注释。

1.5　CircRNA相关miRNA调控靶基因的预测

采用TargetScan数据库、miRBase数据库及miRanda数据库的预测信息，预测circRNA分子相关miRNA调控的靶基因，取3个数据库预测结果的交集。

1.6　CircRNA相关miRNA调控靶基因的GO和KEGG分析

针对circRNA分子相关miRNA调控的靶基因用基因本体(Gene oncology, GO)进行功能富集分类，根据GO的分子功能进行富集分析。应用基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析circRNA分子的生物信号通路。

1.7　临床主要指标的检测

荧光定量PCR检测HBV DNA，试剂盒为上海科华生物工程股份有限公司产品，检测限为小于5×10² IU/mL，所用定量PCR仪器为ABI 7300型(美国ABI公司)。电化学发光法检测HBV血清学标志物。全自动生化分析仪(日本日立株式会社)检测血清生物化学指标。

1.8　统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q法(方差齐时应用)。相关分析采用Pearson分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　慢性HBV感染者circRNA的差异表达

慢性HBV感染者circRNA分子差异表达的聚类分析图见图1。与健康对照者比较，CHB患者PBMC中表达差异的circRNA分子有137个，其中上调89个，下调48个，无上调或下调5倍以上；慢性HBV携带者表达差异的circRNA分子有444个，其中上调130个，上调5倍以上的有34个，如hsa_circ_0087354、hsa_circ_0046968等，下调314个，无下调5倍以上；CHB患者与慢性HBV携带者相比，表达差异的circRNA分子有1 041个，其中上调663个，无上调5倍以上，下调378个，下调超过5倍以上的有54个，如hsa_circ_0038646、hsa_circ_0041555等。

2.2　荧光定量PCR检测circRNA的表达

为了验证芯片的准确性，选取2个芯片检测表达水平5倍以上的circRNA，分别为hsa_circ_0038646和hsa_circ_0087354分子。应用荧光定量PCR方法进行检测。结果显示，hsa_circ_0038646分子和hsa_circ_0087354分子在不同组别的表达水平与芯片检测的表达趋势均一致(表3)。

2.3　CircRNA调控miRNA分子种类及靶点预测

应用Arraystar’s miRNA预测软件对差异表达的circRNA上保守的miRNA结合位点进行预测，并对其中匹配分值较高的位点进行注释。结果显示，差异表达的circRNA上具有miRNA应答元件(microRNA response element，MRE)，可与miRNA上种子区域的碱基互补配对，一种circRNA可与多种miRNA互补配对，如hsa_circ_0038646可与hsa-miR-181b-5p(图2A)、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-329-5p互补配对；hsa_circ_0087354可与hsa-miR-199a-3p(图2B)、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-449a、hsa-miR-449b-5p、hsa-miR-630互补配对。多种circRNA可与一种miRNA互补配对，如hsa_circ_0009610、hsa_circ_0004004均可与hsa-let-7a-2-3p互补配对；hsa_circ_003079、hsa_circ_0034044、hsa_circ_0092337均可与hsa-let-7a-3p互补配对。

2.4　hsa_circ_0038646与hsa_circ_0087354分子调控的靶基因

采用TargetScan数据库、miRBase数据库及miRanda数据库，预测hsa_circ_0038646与hsa_circ_0087354分子相关miRNA调控的靶基因，结果取交集。结果表明：hsa_circ_0038646相关miRNA调控的靶基因有533个，hsa_circ_0087354分子相关miRNA调控的靶基因有249个(图3)。

2.5　hsa_circ_0038646与hsa_circ_0087354分子调控靶基因的GO分析

应用在线GO分类工具对hsa_circ_0038646分子相关miRNA调控基因的功能进行分析，结果发现，hsa_circ_0038646分子相关miRNA调控靶基因的功能主要富集于激活素结合、S100蛋白结合、GDP解离抑制剂活性、转化生长因子受体以及泛素蛋白连接酶等基因活性的调控(图4A)。应用在线GO分类工具对hsa_circ_0087354分子相关miRNA调控基因的功能进行分析，结果发现，hsa_circ_0087354分子相关miRNA调控的靶标富集于犰狳重复区域结合、前体mRNA结合、丝分裂原激活蛋白激酶活性、翻译阻遏物活性以及GTP依赖蛋白结合等基因活性的调控(图4B)。

2.6　hsa_circ_0038646与hsa_circ_0087354分子调控靶基因的KEGG分析

应用基于KEGG的生物通路富集分析，通过Fisher精确检验计算P值，结果表明，hsa_circ_0038646分子相关miRNA主要参与T细胞受体结合途径、雌激素受体信号通路、PI3K-Akt信号途径以及神经轴突导向等信号途径(图5A)。应用基于KEGG的生物通路富集分析，通过Fisher精确检验计算P值，结果表明，hsa_circ_0087354分子相关miRNA主要参与粘附连接、MAPK信号途径、癌症中心碳代谢、Notch信号通路以及GnRH信号通路等途径(图5B)。

2.7　两种circRNA与丙氨酸转氨酶(ALT)及HBV DNA水平的相关分析

4例CHB患者的ALT水平为(519±511)U/L，HBV DNA水平为(6.9±0.78)lg IU/mL。Pearson相关分析显示：hsa_circ_0038646分子表达与ALT水平具有正相关(r＝0.973, P<0.05)。hsa_circ_0038646分子表达与HBV DNA无相关性(r＝－0.256, P>0.05)；hsa_circ_ 0087354分子表达与ALT及HBV DNA水平均无相关性(r＝0.45和－0.707, P值均>0.05)。

3　讨论

CircRNA作为一种新发现的非编码RNA，广泛存在于真核细胞中，具有高度的保守性、稳定性和一定的组织细胞特异性。CircRNA参与复杂的RNA-RNA相互作用网络，在基因转录后调节功能发挥重要作用^[12,13]。CircRNA分子通过与疾病关联的miRNA相互作用，在肿瘤、神经系统等疾病发生发展过程中发挥重要作用^[14,15,16]。CHB的自然史包括免疫耐受期、免疫清除期和免疫控制期，不同阶段CHB患者的免疫功能存在差异，但是导致差异的分子机制尚不清楚^[17]。本研究应用circRNA芯片筛选不同阶段慢性HBV感染者PBMC中circRNA的差异表达。结果表明，与健康对照者比较，CHB患者与慢性HBV携带者PBMC中均存在多个差异表达的circRNA分子。CHB患者与慢性HBV携带者相比，表达差异的circRNA分子更为明显。选取两个芯片检测表达水平在5倍以上的circRNA，荧光定量PCR检测结果显示，hsa_circ_0038646分子和hsa_circ_0087354的表达水平与芯片检测的表达趋势均一致，提示芯片结果可靠。但是hsa_circ_0087354在慢性HBV携带者组和正常对照组比值，差异无统计学意义，可能与样本数量少有关。相关分析表明，CHB患者PBMC中hsa_circ_0038646分子表达与ALT水平呈正相关。以上研究结果提示不同阶段慢性HBV感染者PBMC中存在大量差异表达的circRNA分子，这些差异表达的circRNA在CHB患者免疫功能紊乱机制中的作用有待于进一步探究。

研究表明，circRNA富含miRNA的结合位点，可充当miRNA海绵，调控miRNA的功能^[18]。应用Arraystar’s miRNA靶基因预测软件对差异表达的circRNA上保守的miRNA结合位点进行预测，结果表明，差异表达的circRNA上具有miRNA应答元件(MRE)，能与miRNA上种子区域的碱基互补配对，一种circRNA可与多种miRNA互补配对，而多种circRNA可与一种miRNA互补配对。如hsa_circ_0038646可与hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-329-5p互补配对，其中hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-181a-5p在T细胞的发育和分化过程中发挥关键作用，而hsa-miR-181c-5p可以调控炎症反应的程度^[19,20,21]。Ng等^[22]研究发现一种新的circRNA分子mcircRasGEF1B可以调控成熟细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)mRNA的稳定性，影响内毒素/Toll样受体4(LPS/TLR4)途径中ICAM1功能的发挥，从而参与抗微生物感染的免疫调控。本研究对hsa_circ_0038646与hsa_circ_0087354分子相关的miRNA调控的靶基因进行预测。结果发现：hsa_circ_0038646相关miRNA调控的靶基因有533个，hsa_circ_0087354分子相关miRNA调控的靶基因有249个，提示差异表达的circRNA分子可能通过调控多个靶基因而发挥其调控功能，而具体调控的机制尚需进一步深入的研究。

通过差异基因的GO富集分析，可以找到不同样品的差异基因可能与哪些基因功能的改变相关。本研究对hsa_circ_0038646和hsa_circ_0087354两种分子相关miRNA调控的差异基因进行GO富集分析。结果表明，hsa_circ_0038646分子主要富集于激活素结合、S100蛋白结合、GDP解离抑制剂活性、转化生长因子受体以及泛素蛋白连接酶等基因活性的调控，hsa_circ_0087354分子富集于犰狳重复区域结合、前体mRNA结合、丝分裂原激活蛋白激酶活性、翻译阻遏物活性以及GTP依赖蛋白结合等基因活性的调控。差异基因的Pathway富集分析，可以寻找不同样品差异基因可能与哪些细胞通路的改变有关。本研究对hsa_circ_0038646和hsa_circ_0087354两种分子调控的差异基因进行Pathway分析，结果表明，hsa_circ_0038646分子主要影响T细胞受体结合途径、雌激素受体信号通路、PI3K-Akt信号途径以及神经轴突导向等信号途径，hsa_circ_0087354分子主要影响粘附连接、MAPK信号途径、癌症中心碳代谢、Notch信号通路以及GnRH信号通路等途径。以上结果提示hsa_circ_0038646和hsa_circ_0087354分子可能调控多个基因的功能及其相关的信号途径，从而影响慢性HBV感染者的免疫应答。

综上所述，本研究表明，circRNA在不同阶段CHB患者PBMC中的表达存在明显差异，差异表达的circRNA分子可能通过调控多个靶基因及其信号途径，参与慢性HBV感染者的免疫调控。