转自: 艾博思(微信公众号)
图1:外显子环化位点siRNA设计
图片引自:Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nature structural & molecular biology, 2015, 22(3): 256.
1. 外显子环化circRNA,针对反向剪接位点(backsplice junction)序列设计siRNA;
2. 内含子环化circRNA,可针对反向剪接位点(backsplice junction)序列设计siRNA序列以外,也可针对内含子区域序列设计siRNA;
3. 对于初筛来说,可以选择通用型的对照;如果确定了有效序列,可以针对每个siRNA设计对应特异型的对照,例如反向剪接位点(backsplice junction)位点的一端形成互补配对,而另一端可以放置相应的错配碱基。
小 贴 士
A.环状RNA的siRNA与普通基因的siRNA设计相比,同样遵循siRNA的设计原则和设计规范,同样需要避免脱靶效应,并进行小范围的siRNA靶点筛选。
B.环状RNA的siRNA设计的要点:由于环状RNA来自线性的mRNA或者lncRNA,所以siRNA的7mer种子区(seed region)不要出现在线性宿主基因中。设计之前要看看siRNA位点是否会与其他的mRNA发生100%靶点匹配,100%匹配无法保证特异性,这种circRNA不适合siRNA抑制,有部分同源的也需要尽量避免脱靶到其他基因。为了防止脱靶效应可以在种子区选择一定化学修饰,例如2‘-OMe甲氧修饰,2’-F氟代修饰等等,降低脱靶效应。
C.在使用qRT-PCR或者功能研究验证circRNA时候,线性的宿主基因需要检测一下,并且观察在基因表达水平以及功能水平上,到底是宿主基因还是真正的circRNA在起决定性的作用。
图2:内含子位点ASO设计
图3:反向剪接位点ASO设计
图片引自:Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nature structural & molecular biology, 2015, 22(3): 256.
反义RNA(antisense RNA,ASO)是指与靶RNA具有互补序列的RNA分子,通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式,通过特异阻断翻译或者降解目的RNA方式参与基因的表达调控,。利用ASO特异地封闭某些基因表达,使之低表达或不表达。对于内含子环化circRNA和外显子环化的circRNA同样也可针对内含子区域或者反向剪接位点(backsplice junction)设计相应ASO。至于siRNA和ASO不同之处请点击《聊聊LncRNA研究的技术细节》的解答。
图4:Gapmer反义抑制等位基因
图片引自:Marrosu E, Ala P, Muntoni F, et al. Gapmer antisense oligonucleotides suppress the mutant allele of COL6A3 and restore functional protein in Ullrich muscular dystrophy[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2017, 8: 416-427
Gapmer是一种反义RNA分子,这种RNA分子的末端修饰了化学修饰物,所以更加稳定。Gapmer含有一段中心序列(central sequence),当反义RNA分子与突变的靶序列RNA分子结合之后,这段中心序列就可以借助RNase H的酶活性将突变靶序列降解掉。至于LNA Gapmer见《靶向LncRNA利器:Antisense LNA™ GapmeRs》的解答。
图5:Gapmer抑制环状RNA设计
图片引自:Ottesen E W, Luo D, Seo J, et al. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs[J]. Nucleic acids research, 2019
针对环状RNA连接位点设计Gapmer,设计方案如下:
对照序列:CNTRL-9GAP18
5-mG∗mU∗mC∗mU∗mA∗dT∗dG∗dT∗dC∗dT∗dA∗dT∗dG∗dT∗mC∗mU∗mA∗mU-3;
靶标序列1:Jn4-2B-9GAP18,
5-mU∗mA∗mG∗mA∗mG∗dC∗dA∗dT∗dG∗dC∗dT∗dT∗dT∗dC∗mC∗mU∗mG∗mG-3;
靶标序列2:Jn4-2A-9GAP18,
5-mA∗mU∗mC∗mA∗mU∗dC∗dG∗dC∗dT∗dC∗dT∗dT∗dT∗dC∗mC∗mU∗mG∗mG-3;
靶标序列3:Jn4-3-12GAP23,
5-mC∗mC∗mC∗mA∗mA∗mC∗dT∗dT∗dT∗dC∗dC∗dA∗dC∗dT∗dT∗dT∗dC∗dC∗mU∗mG∗mG∗mU∗mC-3
两端分别为4,5,6个甲氧基修饰的RNA碱基,中间9个或者12个DNA碱基。
图6:哺乳动物环状RNA(Cdr1as/ciR-7)基因座的缺失导致miRNA失调并影响脑功能
图片引自:Piwecka M, Glažar P, Hernandez-Miranda L R, et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function[J]. Science, 2017, 357(6357): eaam8526.
我们可以利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9,通过双sgRNA设计选择性删除了小鼠中的Cdr1as基因。既然是CRIPSR/Cas9技术,必须遵循sgRNA设计原则并克服其技术优缺点。虽然是CRISPCR/Cas9同样无法避免脱靶(off-target)效应。同样需要考虑宿主基因的缺失对功能的影响。技术细节可以参考《lncRNA CRISPR文库筛选技术》 。
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