环状RNA(circular RNA,circRNA)不同于传统意义上的线性RNA分子，是一大类具有闭合环状结构的特殊非编码RNA。circRNA由于其闭合环状结构，不易受RNA外切酶影响，因此不易降解，表达更稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。对于circRNA的高通量筛选，实践证明，基因芯片是一个非常好的选择。

当然，基因芯片只是前期的筛选平台，当完成这一步后，怎么进行qRT-PCR验证呢？circRNA的定量验证到底和线性RNA（mRNA/lncRNA）有什么不同的地方呢？让我们一起来看看。

circRNA验证引物设计原则

circRNAs区别于线性RNA的原因在于circRNA来源于RNA转录本的反向剪接（backsplice）。因此，circular RNA验证时采用和线性mRNA分子引物方向相反的方式(Divergent PCR)，用扩增区域覆盖剪接位点的反向引物能扩增出来证明其特异性表达。

备注：蓝色引物用于特异性检测circRNA，红色引物用于特异性检测线性RNA。

circRNA引物设计序列的获取

以SBC human circRNA array为例，其探针长度为60 nt，包含circRNA剪接位点。因此，从反向引物设计原则和引物与探针匹配的原则进行引物设计。具体分析过程如下：
做完芯片后，公司提供差异circRNA的全序列信息，如：

hsa_circ_0000027在芯片注释表中的探针序列（芯片结果表中直接给出）：

通过将探针序列与对应circRNA全序列的比对，可以看出探针序列为circRNA全序列的末位序列与起始序列反向拼接而成。拼接点的两个探针GG分别为hsa_circ_0000027的头和尾碱基（剪接位点）。设计验证引物时，先构建剪接位点左右150 bp的线性序列，如下：

以上300 nt的序列就是以剪接位点为界限，上下游各取150 nt的序列反向拼接而成。为验证该序列的特异性，可通过NCBI进行BLAST，确认其唯一性。

从NCBI结果可以看到，该序列是ECE1的两个不连续完整片段，因此，是来源于ECE1特有的circRNA。如果提供的circRNA全长序列小于300 nt，可通过首尾拼接构建包含剪接位点的线性序列用于定量引物设计。

反向拼接获得的引物设计序列可以直接按照常规的mRNA设计原则进行引物设计。

此外，您也可以通过数据库circBase（http://circbase.org/）获取circRNA的序列信息，具体方法如下：

点击search即可下载circRNA序列。

批量circRNA序列查找：

点击search，按上述方法即可批量获得circRNA序列。

总结

circRNA定量验证的关键在于反向引物的设计，其核心是构建包含反向剪切位点的引物设计序列。获得引物设计序列后，即可按mRNA的引物设计原则进行引物设计，上下游引物因设计在剪切位点的两侧，确保扩增序列包含剪切位点。CircRNA的qRT-PCR引物设计，您是否已经GET到了？