转自: 生信菜鸟团(微信公众号）

上一期我们说到，使用不同的生物信息工具分析同一组数据可能获得不同的结果，自然而然出现了一些评估程序的文章。简单重复一下主要结论，在circRNA数据分析中，测序文库需要RNase 处理；面对质量不高的数据，应对数据过滤后再进行分析；有参优于 De Novo分析；结合各个识别程序的优势，取两个以上程序的鉴定结果交集，会进一步降低预测的假阳性。今天的推文带来武器库中的第二把利器：KNIFE。

已有多篇报道评估，KNIFE这么稳定输出的程序我们来看一下究竟。

原理简述

使用统计学模型提高对RNA-seq数据circRNA分析的敏感性和特异性。对于PE数据，使用 Bowtie2 分别独立map到genome, ribosomal RNA, linear exon–exon junctions, and scrambled exon–exon junctions。被标记为 “junctional” 的读段，read1 (R1)必须覆盖设定的核苷酸数量，且并未比对到基因组和核糖体组。假阳性有以下两种情况：

1、those that map to canonical linear isoforms (“real” alignments)

2、those which are likely artifacts because the relative alignment orientations of the paired-end reads are consistent with neither a linear nor a circular RNA (“decoy”
alignments)

即一是比对到了线性转录本上，二是指比对上的序列方向是一致的。

为了应对 decoy reads，作者拟合了一个logistic generalized linear model (GLM)，参数包含 alignment score (a composite of sequencing quality and mismatchrate), mapping quality, and offset position，并计算真阳性概率，最终获得的 cirular junctions 超过90%与decoy reads较低关联。

流程介绍

根据介绍，程序被包装到一个shell脚本中，这个轮子还是很好用的。

1、首先根据要求构建分析环境

需要注意的切换 python2 的使用环境，bowtie 主要用于 de novo 分析流程中。

2、从github上获取基本信息，由于开发板还存有一些bug，因此选择v1.4稳定版内容

   $ wget https://github.com/lindaszabo/KNIFE/archive/v1.4.tar.gz
   $ tar zxvf v1.4.tar.gz
   # 添加执行权限，否则运行过程中会由于部分软件无执行权限报错。
   $ cd KNIFE-v1.4/circularRNApipeline_Standalone/analysis
   $ sudo chmod a+x *

3、根据作者提供的数据进行测试，作者将构建好的索引打包至 MEGA 网盘，链接如下：https://mega.nz/#F!RtsCHCQb!fyxYNWjoCef5Ie361vUxiA。亲测可用，下载平均速度在5m/s。随后下载测试数据，测试数据为人类样本，因此索引下载hg19。

   # 将下载好的索引移至一下位置
   $ cd circularRNApipeline_Standalone/denovo_scripts/index
   $ tar zxvf hg19_BT1index.tar.gz
   # 并将hg19的gtf注释文件移入以下的路径中
   $ cd circularRNApipeline_Standalone/index
   $ tar zxvf hg19_BT2index.tar.gz
   # 下载测试数据
   $ cd circularRNApipeline_Standalone/testData
   $ wget -c https://github.com/lindaszabo/KNIFE/releases/download/v1.1/SRR1027187_*.fq.gz

4、测试

   $ cd circularRNApipeline_Standalone
   $ sh completeRun.sh ./testData/ complete ./new testData 8 phred64 circReads 40 2>&1 | tee out.log

结果文件应该包含

• SRR1027187_1_linearJuncProbs.txt and SRR1027187_1_circJuncProbs.txt
• SampleAlignStats.txt and SampleCircStats.txt

同时，作者提供自建索引的方法，可以详见 INSTALL。就酱。