原创： 风大爷|荷风生物

随着对各种类型的非编码RNA的研究逐渐深入，研究者发现作为海绵吸附miRNA并不是circRNA独有的功能，而是一种普遍现象。本文（发表在Cancerresearch IF：8.378）中的lncRNAFAM225A便是通过ceRNA机制调节癌症的发展。虽然本文的研究的亮点很明显，比如m6A甲基化修饰和FAM225A富集miRNA，但是思路上整体而言比较常规，适合模仿学习！

技术路线：

结果如下：

1、FAM225A在鼻咽癌中过表达，与临床预后不良有关；FAM225A的m6A修饰，提高了其转录产物的稳定性

A.三对NPC和正常鼻咽组织之间差异表达lncRNA的热图。B. FAM225A在NPC（n= 20）中的表达上调。C.NP69，N2Tert细胞和11个NPC细胞系中的FAM225A表达水平。D-F.Kaplan-Meier分析FAM225A表达与总体存活率之间的相关性。总生存期（G），无病生存期（H）和无远处转移生存期（I）的Kaplan-Meier分析。J.在低，中和高风险组的患者中通过MeRIP-qPCR测定正常鼻咽上皮细胞（NP69，N2Tert）和NPC细胞（SUNE-1和HONE-1）中FAM225A的甲基化水平。 K.METTL3切片后m6A修饰的FAM225A水平的变化。 L.阴性对照和sh-METTL3 SUNE-1细胞中METTL3和FAM225A的转录水平。 M.与对照相比，METTL3敲低的SUNE-1细胞中FAM225A RNA稳定性降低。

图1. m6A修饰的FAM225A在NPC中过表达并且与不良临床结果相关。

2、FAM225A促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

A.基于公共GSE12452数据集，基因富集分析（GSEA）显示，FAM225A高表达，与增殖和迁移等生物学功能相关。转染shRNA-FAM225As或对照（B）的HNE-1和SUNE-1细胞以及用pSin-EF2-FAM225A或空载体转染的NP69和N2Tert中FAM225A的表达（C）。D. G.增殖，迁移和迁徙情况统计。

图2 FAM225A促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

图3. FAM225A促进NPC细胞迁移和侵袭。

3、FAM225A作为ceRNA机制，竞争性地吸附miR-590-3p和miR-1275

A.生物信息学预测FAM225A主要位于细胞质中。B. SUNE-1，HONE-1和HNE-1细胞的细胞核和细胞质中亚细胞FAM225A表达量。C.通过RNA-FISH检测SUNE-1和HNE-1细胞中FAM225A的亚细胞定位。 D. Ago2-RIP过程的示意图。E.在HNE-1和SUNE-1中FAM225A的富集。F-G用miR-590-3p，miR-1275mimics或miR-Ctrl转染的HNE-1和SUNE-1细胞中FAM225A的富集（F）。通过WB检测Ago2抗体或IgG免疫沉淀的Ago2蛋白 （G）。H.预测的FAM225A中与miR-590-3p和miR-1275结合位点。 I-J. HNE-1中的荧光素酶活性 K.生物素-miR-590-3p，生物素-miR-1275或阴性对照下调FAM225A的表达。 L-M用sh-FAM225A＃2或对照转染的HNE-1和SUNE-1细胞中miR-590-3p（L）和miR-1275（M）的相对水平。N.用miR-590-3p或miR-1275mimics或miR-Ctrl转染的HNE-1和SUNE-1细胞中FAM225A的相对水平。

图4. FAM225A充当ceRNA并竞争性吸附miR 590-3p和miR-1275。

5、FAM225A诱导miR-590-3p和miR-1275上调它们共同靶基因ITGB3

A.用miR-590-3p或miR-1275mimics或miR-Ctrl转染的HNE-1和SUNE-1细胞中ITGB3的相对mRNA和蛋白质表达水平。B.用miR-590-3p或miR-1275抑制剂或抗-Ctrl转染的HNE-1和SUNE-1细胞中ITGB3的相对mRNA和蛋白质表达水平。C.预测的ITR3的3′-UTR中miR-590-3p和miR-1275的结合位点。D-EHNE-1（D）和SUNE-1（E）细胞中的荧光素酶活性。F.通过生物素标记的miR-590-3p和 miR-1275或阴性对照下调ITGB3的表达。用sh-FAM225As或其对照（G）以及pSin-EF2-FAM225A或其空载体转染的HNE-1和SUNE-1细胞中ITGB3的相对mRNA和蛋白质表达水平。I.基于GEO数据库（GSE12452）的FAM225A和ITGB3表达之间的相关性。J.用shFAM225A＃2或对照与miR-590-3p或miR-1275抑制剂共转染的细胞中，ITGB3的表达和FAK（p-FAK）和Akt（p-Akt）的磷酸化水平。K.用psin-EF2-FAM225A或空载体与miR-590-3p或miR-1275模拟物共转染的细胞中ITGB3，p-FAK和p-Akt的表达。

图5.FAM225A作为miR-590-3p和miR-1275的诱饵起作用以增加ITGB3表达。

6、ITGB3负责FAM225A介导的细胞增殖、迁移和侵袭

J. 提出的FAM225A在NPC细胞增殖和迁移中的表达和发挥功能的机制模型。

图6. ITGB3负责FAM225A介导的增殖，迁移和侵袭。

7、FAM225A在体内促进鼻咽癌细胞的发生和转移

这部分是将实验结果回归人体，检验模型是否可靠，主要检测了肿瘤（A），肿瘤体积生长曲线（B）和形成的肿瘤的重量（C）。原位杂交和免疫组织化学检测肿瘤中的FAM225A和ITGB3表达。肺表面上宏观转移性结节的定量（G）。

肿瘤和转移性腹股沟淋巴结（H）的代表性图像，以及HE染色后显微原发性肿瘤（I）代表性图像（J）和腹股沟淋巴结体积的量化（K）及腹股沟淋巴结转移率（L）。

图7.FAM225A在体内促进NPC细胞肿瘤发生和转移。

参考文献：Zheng Zi-Qi., LiZhi-Xuan., Zhou Guan-Qun., Lin Li., Zhang Lu-Lu., Lv Jia-Wei., Huang Xiao-Dan.,Liu Rui-Qi., Chen FoPing., He Xiao-Jun., Kou Jia., Zhang Jian., Wen Xin., LiYing-Qin., Ma Jun., Liu Na., Sun Ying., (2019). Long non-coding RNA FAM225Apromotes nasopharyngeal carcinoma tumorigenesis and metastasis by acting asceRNA to sponge miR-590-3p/miR-1275 and upregulate ITGB3., Cancer Res., 08.