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 小拜|英拜生物

 

在这里,和小编一起探索5个LUSC配对样本中circRNA和mRNA的表达谱。 通过分析差异表达的circRNA和失调的mRNA的共表达网络,寻找出关键的调节基因——circTP63。
结果分析:

 

1、circTP63在LUSC中上调表达

 

通过同时分析circRNA 和mRNA在5对配对的LUSC样品和健康组织中的表达谱,一共鉴定出7081个异常表达的circRNA,其中上调的有3157,下调的有3924个,差异表达的mRNA鉴定出2932个,其中上调的有979个,下调的有1853个(图1a step 1, 图1b)。选出差异最显著的前50个circRNA,从KEGG分析中挑选最显著的细胞周期途径中的109个基因,对50个circRNA和109个mRNA做共表达分析(图1a step 2,图1 c),筛选出6个可能参与细胞调控的circRNA(图1a step 3)。对这6个circRNA做RNase R酶消化处理和RT-PCR验证,筛选出hsa_circ_0068515(circTP63)(图1a step 4,图1 d)。微阵列数据分析显示circTP63上调表达(图1e),qRT-PCR结果显示circTP63在LUSC组织中显著上调表达(图1f)。并且LUSC组织中circTP63的表达增加与肿瘤体积的增大和患者TNM分期的升高呈显著相关(Table 1)。

 

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图1 circRNA表达图揭示circTP63在LUSC中上调表达

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2、circTP63在LUSC细胞中的特征

 

作者评估了circTP63的外显子结构,circTP63是由CTP63基因的10到11的外显子反向剪切连接衍生而来(图2a)。PCR分析表明不同的引物可以扩增来自cDNA的产物,但不能扩增来自gDNA的产物(图2b)。Northern blot结果表明circTP63可以在295nt出检测到,与预测大小一致(图2c)。用转录抑制剂Dactinomycin处理的H1703细胞中circTP63和TP63,结果表明circTP63的半衰期超过24h,稳定性比TP63好(图2d)。circTP63转录产物优先定位于细胞质中(图2e)。

 

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图2 circTP63在LUSC细胞中的特征

 

3、circTP63促进细胞增殖和肿瘤生长

 

我们发现在SW900和H1703细胞中,circTP63 siRNAs可以成功地下调circTP63的表达,但对TP63 mRNA的表达没有影响(图3a)。circTP63在H226和H2170细胞中过表达,TP63 mRNA表达无明显变化(图3b)。表明TP63的表达不受circTP63的影响。沉默circTP63可以明显抑制细胞增长(图3c)。稳定过表达circTP63可以显著提高细胞的存活率(图3d)。细胞周期分析表明,与对照组相比,沉默circTP63可减少G2/M期细胞数量,但增加G1期细胞数量(图3e)。circTP63的异位表达导致细胞从G1/S期向G2/M期发展(图3f)。我们发现circTP63的过表达显著增加了H2170细胞的肿瘤生长,circTP63可显著提高肿瘤体积和重量(图3g)。si-circTP63明显抑制了H1703中肿瘤的生长(图3h)。

 

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图3 circTP63促进细胞增殖和肿瘤生长

 

4、circTP63通过靶向FOXM1促进细胞增殖

 

在共表达网络中,根据Pearson相关系数值筛选25个相关的mRNA(图4a)。微阵列数据显示,25个mRNA在LUSC组织中显著上调,FOXM1在LUSC中上调超过8倍(图4b)。我们进一步确认了35对LUSC样品中FOXM1的上调水平(图4c)。与KIF18B或BRCA1相比,circTP63的表达与FOXM1呈最显著的正相关(图4d)。FOXM1在LUSC组织中显著上调,与circTP63呈正相关(图4e)。qRT-PCR和western blot结果显示,circTP63敲低显著降低了FOXM1 mRNA和蛋白的表达水平,而当circTP63过表达时则相反(图4f)。因此认为FOXM1是circTP63的一个重要靶基因。FOXM1的敲除可以抵消circTP63促进细胞增殖的作用(图4g),而FOXM1的过表达可以通过敲除circTP63,显著挽救H1703细胞的增殖抑制(图4h)。

 

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图4 circTP63通过靶向FOXM1促进细胞增殖

 

5、circTP63可以减轻miR-873-3p对FOXM1的抑制

 

构建了circtp63 - miRNA - foxm1网络,包括22个候选miRNA,包含circTP63和FOXM1的共同结合位点(图5a)。我们观察到多个miRNA能够降低荧光素酶活性,其中miR-873-3p下降最多,至少80%(图5b)。然后作者构建了AGO2免疫沉淀系统检测circTP63是否作为AGO2和miR-873-3p的平台,如图5c所示,转染细胞中circTP63在miR-873-3p中特异性富集。荧光素酶报告基因检测显示,与对照或突变相比,转染miR-873-3p后,circTP63或FOXM1野生型报告基因的荧光素酶活性显著降低(图5 d)。作者发现,circTP63过表达或敲除可以进一步增加或降低FOXM1野生型报告基因的荧光素酶活性(图5e)。在miR-873-3p捕获的分数中,与阴性对照组比较,circTP63和FOXM1分别有近三倍和近六倍的富集,过表达circTP63 会导致FOXM1 在miR-873-3p 中的富集减少(图5f)。作者还在细胞中评估了过表达miR-873-3p后FOXM1的表达。结果表明,miR-873-3p显著降低了FOXM1表达,但circTP63过表达挽救了FOXM1的表达(图5g)。作者研究了miR-873-3p对细胞增殖的影响,miR-873-3p过表达抑制细胞增殖,而circTP63过表达可挽救miR-873-3p介导的细胞增殖和周期抑制(图5h)。

 

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图5 circTP63可以减轻miR-873-3p对FOXM1的抑制

 

6、circTP63通过FOXM1调控CENPA和CENPB

 

在circTP63过表达后检测8个候选基因的mRNA水平,结果表明,CENPA、CENPB、CCNB1均受circTP63调控,另有5细胞周期相关基因无明显变化(图6a)。FOXM1 siRNAs显著减弱了circTP63对CENPA和CENPB的影响(图6b)。细胞增殖分析表明,单独敲除CENPA或CENPB可降低circTP63过表达对细胞增殖的影响,当同时敲除CENPA和CENPB时,细胞增殖抑制作用更为显著(图6c)。FOXM1的升高可促进CENPA和CENPB的表达,然后驱动细胞周期进展和细胞增殖(图6d)。

 

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图6 circTP63通过FOXM1调控CENPA和CENPB

 

结论:

 

circTP63竞争性结合miR-873-3p,消除miR-873-3p对FOXM1的抑制作用,进而促进细胞增殖。

 

参考文献:Cheng Zhuoan,Yu Chengtao,Cui Shaohua et al. circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.[J] .Nat Commun, 2019, 10: 3200. IF:11.878

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