转自|欧易生物

英文标题：Circular RNA circNHSL1 promotes gastric cancer progression through the miR-1306-3p/SIX1/vimentin axis

中文标题：环状RNA circNHSL1通过miR-1306-3p/SIX1/vimentin调控轴促进胃癌进程

发表期刊：Molecular Cancer

影响因子：10.679

发表时间：2019年8月

作者单位：上海交通大学附属第一人民医院，上海交通大学医学院

研究技术：全转录组测序（欧易生物提供）

研究背景

胃癌是全球第五大最常见的癌症，也是导致世界范围内癌症相关死亡的第三大原因。胃癌作为最常见的消化道恶性肿瘤之一，其在早期难以诊断，且进展迅速，多数患者在晚期时才被诊断出来，5年生存率低于30%。而导致晚期胃癌预后不良的主要原因就在于其转移性。因此阐明胃癌发展、转移的分子机制，发现早期诊断和治疗的新型分子靶点迫在眉睫。

circRNA是一种新兴起的非编码RNA，近年来被发现在多种分子机制中发挥作用，如作为microRNA海绵、翻译蛋白和结合RNA结合蛋白等。其中miRNA海绵是circRNA在肿瘤的发生发展中最常见的作用。尽管在胃癌中已有几种circRNA被报道，但很少有肿瘤转移相关的circRNA及其功能和分子机制被报道。

技术路线

研究结果

1、circNHSL1在胃癌组织中上调，并与疾病进程和预后不良相关

作者通过对3例未转移胃癌组织和2例转移胃癌组织进行全转录组测序，筛选出37个在转移胃癌组织中显著上调的circRNA，1个下调circRNA（Fig 1a）。从中选取了上调最多的circNHSL1，设计了divergent和convergent两对引物，通过一代测序（Fig 1b）、以cDNA和gDNA为模板进行PCR（Fig 1d，e）、RNase R处理（Fig 1f）的方法验证circNHSL1成环，并在不同的胃癌细胞系及正常人胃上皮细胞系中验证其表达量，发现在多种胃癌细胞系中circNHSL1表达显著高于正常细胞系（Fig 1c）。

随后作者对93对冰冻的胃癌组织及正常组织进行qPCR定量，发现癌症组织中circNHSL1表达显著升高（Fig 1h），并且M1期胃癌组织中的表达显著高于M0期（Fig 1i），通过Kaplan-Meier生存分析发现，高表达circNHSL1的病人的总体生存期及无病生存期显著低于低表达病人（Fig 1j）。

Fig 1. circNHSL1在胃癌组织中表达上调，与胃癌的进展及预后不良相关

2、circNHSL1体外促进胃癌细胞的迁移和侵袭

作者在高表达circNHSL1的胃癌细胞系中敲降circNHSL1（Fig 2a），在低表达的胃癌细胞系中过表达circNHSL1（Fig 2b），通过wound healing和transwell实验，发现敲降circNHSL1后，胃癌细胞的迁移、侵袭能力显著降低（Fig 2c），过表达后呈现相反的结果（Fig 2d），这说明circNHSL1在体外能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭。

Fig 2. circNHSL1体外促进胃癌细胞的迁移和侵袭

3、circNHSL1通过SIX1基因促进胃癌的进程

作者通过全转录组测序，筛选到胃癌转移相关的mRNA，选取其中top10的上调基因进行验证（Fig 3a）。MAP4K4和SIX1的表达同时在两个敲降circNHSL1的细胞系中显著下调（Fig 3b，d），而AMOT和SIX1同时在两个过表达circNHSL1的细胞系中显著上调（fig 3c，d），并且发现胃癌组织中SIX1与circNHSL1的表达呈正相关（Fig 3g，h），因此作者猜测SIX1为circNHSL的下游靶基因。他们通过挽救实验，即在敲降circNHSL1的同时过表达SIX1，以及过表达circNHSL1的同时敲降SIX1（Fig 3e，f），发现SIX1可以挽救circNHSL1表达量改变导致的细胞表型（Fig 3i，j），这说明circNHSL1通过SIX1促进胃癌的进程。

Fig 3. circNHSL1通过SIX1基因促进胃癌的进程

4、SIX1通过转录调节Vimentin促进胃癌进程

SIX1是一种转录因子，作者通过软件预测了SIX的靶基因，发现在Vimentin基因启动子上存在两个潜在的SIX结合位点（Fig 4d），而Vimentin是一种与肿瘤转移相关的蛋白。作者随后在胃癌组织中发现两者的表达量呈正相关（Fig 4a），敲降或过表达SIX1在mRNA及蛋白水平上改变了Vimentin的表达（Fig 4b, c）。最后作者通过荧光素酶报告实验验证了SIX1与Vimentin的启动子存在相互作用。

Fig 4. SIX1转录调节Vimentin的表达

5、circNHSL1作为ceRNA，通过与SIX1竞争结合miR-1306-3p，促进胃癌进程

作者通过数据库预测发现circNHSL1与SIX1具有共同的miR-1306-3p结合元件且预测得分高，因此以miR-1306-3p为对象，研究circNHSL1调控的ceRNA网络。作者发现在胃癌组织中，miR-1306-3p的表达量与circNHSL1呈负相关（Fig 5a），在胃癌细胞中敲降或过表达circNHSL1会导致miR-1306-3p的表达上升或下降（Fig 5b）。随后，作者通过荧光素酶报告实验（Fig 5c，d），以及anti-AGO2 RIP实验（Fig 5e， f），验证了circNHSL1与miR-1306-3p之间存在直接的互作关系。为了验证miR-1306-3p在胃癌进程中起到的作用，作者又通过miR-1306-3p的抑制剂和mimics进行了挽救实验，发现miR-1306-3p能够挽救circNHSL1对胃癌细胞的作用（Fig 5h-k）。

Fig 5. circNHSL1通过充当miR-1306-3p的海绵促进胃癌进程

之后作者为验证miR-1306-3p与SIX1的互作关系，先通过定量PCR和原位杂交技术，验证miR-1306-3p与SIX1的表达呈负相关（Fig. 7b-d），过表达或抑制miR-1306-3p可以显著改变SIX1及Vimentin的mRNA和蛋白水平（Fig. 7e, f），通过荧光素酶报告实验验证了miR-1306-3p与SIX1存在直接互作关系（Fig. 7g, h），最后通过挽救实验发现，miR-1306-3p能够挽救SIX促进的胃癌进程（Fig. 7i, j）。

Fig 7. miR-1306-3p通过直接靶向SIX1抑制胃癌进程

综上，作者阐明了circNHSL1/miR-1306-3p/SIX1 ceRNA调控网络调控胃癌的进程。

6、miR-1306-3p在胃癌组织中表达下调，并且与胃癌的进展及预后不良有关

作者通过原位杂交技术检测了miR-1306-3p在胃癌组织及其配对正常组织中的表达（Fig 6a），发现相较于正常组织，其在胃癌组织的表达出现下调（Fig. 6b），并且与胃癌TNM分期、分化程度具有显著的关系（Fig. 6c-f），经Kaplan-Meier生存分析，发现低表达miR-1306-3p的患者预后较高表达miR-1306-3p的患者差（Fig. 6g, h）。

Fig. 6 miR-1306-3p在胃癌组织中表达下调，并且与胃癌的进展及预后不良有关

7、circNHSL1促进胃癌细胞在体内的生长和转移

作者通过异种移植，在小鼠皮下注射敲降或过表达circNHSL1的胃癌细胞，发现敲降circNHSL1的胃癌细胞在小鼠体内生长的体积和质量显著降低（Fig. 8a-c），而过表达circNHSL1的胃癌细胞呈现相反的表型（Fig. 8d-f）。此外，作者通过体内肝转移和腹膜转移实验，证实了circNHSL1能够促进胃癌细胞在小鼠的肝及腹膜中的转移（Fig 8g-j）。

Fig. 8 circNHSL1促进胃癌细胞在体内的生长和转移

研究结论

作者通过全转录组测序技术，发现了一种与胃癌转移相关的新型circRNA——circNHSL1，其在胃癌组织中高表达，且与患者的预后不良相关。通过体内外功能研究验证了circNHSL1能够促进胃癌细胞的侵袭和转移，促进胃癌进程。经过一系列的机制研究，作者阐明了circNHSL1可以作为一种竞争内源性RNA（ceRNA），通过与SIX1竞争结合miR-1306-3p，间接调控SIX1的表达水平，从而调控胃癌进程。同时，研究发现circNHSL1和miR-1306-3p均有望成为胃癌预后的biomarker，为胃癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点。

参考文献

Zhu Z, Rong ZY, et al. Circular RNA circNHSL1 promotes gastric cancer progression through the miR-1306- 3p/SIX1/vimentin axis. Molecular Cancer. 2019, 18:126.