肝细胞癌进展期间的circRNA谱及其变化研究

原创： 瘤学生 |微信公众号：探肝

环状RNA（circRNA）是一种特殊类型的非编码RNA，被认为是一种新型的内源性非编码RNA，起源于前体mRNA的反向剪接，可通过其miRNA反应元件参与包括肿瘤的发生在内的各种生物过程。一些研究已经发现特定的circRNA可以通过与microRNA反应元件竞争来负调节miRNA活性，从而起到miRNA抑制剂的作用。此外，越来越多的证据表明，circRNA通过参与miRNA的相互作用在多种人类疾病中发挥关键作用。随着先进测序技术和生物信息学的发展，在HCC发展研究过程中鉴定出越来越多的circRNA，但是仍然缺乏对HCC中circRNA谱的全面了解。因此，在HCC病理过程中鉴定和研究circRNA谱及其改变将是非常有价值的，这可为未来深入研究circRNA功能提供基础信息。
该研究收集了来自10名乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC患者的原发性HCC肿瘤和配对癌旁组织，以分析在HCC进展期间的circRNA谱及其变化。进一步筛选出了一个明显下调的circRNA (circADAMTS13)，深入研究了该circADAMTS13的功能、机制及其临床意义，为进一步阐明circRNA在HCC中的作用提供了基础信息。

文章题目：Circular RNA profiling identifies circADAMTS13 as a miR-484 sponge which suppresses cell proliferation in hepatocellular carcinoma

杂志名称：Molecular Oncology

发布日期：2019.01

研究结果

鉴定HCC肿瘤和配对肿瘤组织中的circRNA谱

为了表征参与HCC进展的circRNA谱，对10对HCC肿瘤及配对癌旁组织进行RNA测序，每个样本平均得到5300万条reads。利用生物信息学工具TopHat2，基于未比对reads的比对鉴定肿瘤和癌旁组织中的circRNA（图1A）。这20个组织样品总共鉴定出92204个circRNA，它们具有两种以上独特的反向剪接序列。在circBase的其他研究中已鉴定出20 404个circRNA（23.13％），剩余的71 800 circRNA（77.87％）为新鉴定的circRNA。使用Ensemble数据库进一步对这些候选circRNA进行注释，发现其中81.9％在外显子中被鉴定，其他来自非编码区：3.7%位于内含子区域，2.7％位于3'UTR区域，1%位于5'UTR区域（图1B）。与先前的研究一致，结果表明，鉴定的circRNA长度大多在100-450个核苷酸（图1C）。此外，对来自宿主基因的circRNA数量的分析显示，一个宿主基因平均产生8个circRNA（范围从1到175）（图1D）。此外，基于该基因的位置，这些circRNA均匀分布每个染色体上，HCC肿瘤与配对癌旁组织样本之间无明显差异（图1 E）。随后，通过提取组织特异性和非特异性circRNA，发现35302个circRNA（38.29％）在HCC肿瘤或配对癌旁组织样本中特异性表达。对于每个样品的组织特异性circRNA的数目如图1F所示，表明个体间circRNA形成的高度异质性。

图1. HCC肿瘤及癌旁组织中circRNA的鉴定

特异性circRNA与HCC进展相关

为了进一步鉴定在HCC进展期间circRNA的失调，使用limma软件比较HCC肿瘤和配对癌旁组织之间的circRNA表达值。与配对癌旁组织相比，所有HCC肿瘤组织样本中共有42个circRNA表达失调，大多数circRNA（38/42）在HCC组织样本中下调表达（图2 A）。结果表明这些circRNA表达水平的波动可能与HCC的发展有关。那些失调circRNA的反向拼接reads（back-spliced reads）和表达模式分别如图2B-C所示。选择了三个具有最显着表达水平变化的circRNA和大量的反向拼接reads来验证它们在另外26个HCC患者中的表达，随后在HCC肿瘤和配对癌旁组织中使用各自不同的引物扩增了这三个circRNA。如图2 D所示，与癌旁组织和健康肝组织样本相比，这三种circRNA的表达水平在HCC肿瘤组织样本中显着下调（图2D）。结果表明circADAMTS13和circDPF3可能参与HCC进展。

为了研究circADAMTS13和circDPF3在HCC进展中的作用，接下来分析了这两种circRNA的表达水平与102名HCC患者的临床特征之间的关联。Kaplan-Meier分析表明，低表达circADAMTS13的HCC患者有显著较短的无进展生存期（RFS）（图2E）。这些数据表明，HCC中circADAMTS13表达的下调与患者预后不良显著相关。因此，circADAMTS13可能代表了一种新的HCC潜在预后生物标志物，并被选择用于进一步的机制研究。

图2. HCC中circRNA的差异表达分析

环状RNA circADAMTS13的特征

在ADMATS13基因座中鉴定了7种circRNA亚型（图3A）。有趣的是，与其他亚型相比，只有circADAMTS13亚型具有高反向可变剪切（back-splicing）的独特剪接reads（83）。qRT-PCR测定法显示，circADAMTS13用半衰期 > 24小时，非常稳定；而线性ADAMTS13 mRNA的半衰期 <4个小时（图3B）。消化抗性实验进一步证实，circADAMTS13可能对RNase R有抗性，而线性ADAMTS13 mRNA很容易降解（图3C）。总之，我们的结果显示circADAMTS13具有高度结构稳定性，这与circRNA的一般特征一致。

图3. circADAMTS13的特征

CircADAMTS13可抑制HCC细胞增殖

为了探讨circADAMTS13在HCC进展中的功能作用，首先在肝脏来源的六个肿瘤细胞系中评估circADAMTS13的表达。如图4 A所示，PLC/PRF/5和HepG2的circADAMTS13表达水平相对较低。因此，选择PLC/PRF/5和HepG2细胞通过慢病毒转导建立稳定的circADAMTS13过表达细胞模型。通过qRT-PCR验证了circADAMTS13在转染的PLC/PRF/5和HepG2细胞中的过表达效率。qRT-PCR的结果表明，circADAMTS13在ex-circADAMTS13-PLC/PRF/5细胞中过表达约23倍，在ex-circADAMTS13-HepG2细胞中过表达约15倍（图4B）。

进一步研究了circADAMTS13过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。CCK-8和菌落形成实验均表明，circADAMTS13过表达对PLC/PRF/5和HepG2细胞增殖有较强的抑制作用（图4 C-F）。此外，根据流式细胞术分析，circADAMTS13过表达增加了凋亡细胞与模拟细胞的比例，表明circADAMTS13的对细胞凋亡的调控作用；然而，HCC细胞的迁移和侵袭能力没有显著改变。这些结果表明，circADAMTS13在HCC细胞增殖抑制和凋亡中发挥重要作用，但不影响细胞迁移和侵袭，与之前的临床结果一致。

图4. circADAMTS13抑制HCC细胞的增殖

CircADAMTS13作为致癌miR-484的海绵

作者试图掌握在HCC进展期间circADAMTS13的潜在分子机制。由于癌症相关circRNA的功能主要是作为miRNA海绵结合功能性miRNA，然后调节癌症相关信号通路，作者使用了三个独立的miRNA数据库（miRanda，Targetscan和RNAhybrid）预测circADAMTS13结合miRNA。如图5A所示，总共35个miRNA被预测为circADAMTS13可能的下游靶点。在所有这些候选miRNA中，miR-484是一种新发现的HCC恶性转化关键分子，与circADAMTS13具有很强的结合能力。通过Targetscan进行的生物信息学预测搜索也表明，circADAMTS13可以通过miRNA种子序列匹配的方式来携带miR-484（图5B）。这些电子计算机分析结果支持了circADAMTS13可能作为致癌miR-484的结合平台的假设。为了验证这一假设，作者对miR-484进行了荧光素酶筛选。circADAMTS13-WT和circADAMTS13-MUT被插入萤光素酶报告基因的下游（图5C）。然后将miR-484模拟物与荧光素酶报告基因共转染到PLC/PRF/5和HepG2细胞中。与对照miRNA（称为NC）相比，miR-484能够将PLC/PRF/5和HepG2中circADAMTS13的荧光素酶报告基因活性分别降低~30％和~40％，而miR-484对circADAMTS13突变靶区荧光素酶活性无显著影响（图5D）。这些结果表明circADAMTS13可直接与miR-484结合。

为了确定circADAMTS13是否可以通过海绵miR-484影响HCC中的细胞增殖，我们使用PLC/PRF/5和用circADAMTS13过表达载体（或模拟）转染的HepG2细胞结合miR-484或NC进行菌落形成测定。结果表明，circADAMTS13过表达显著抑制HCC细胞克隆性，而同时上调miR-484则可显著缓解circADAMTS13的抑制作用（图5E-F）。总之，这些结果表明circADAMTS13通过调控miR-484的活性，起到了抑癌作用。

图5. CircADAMTS13作为致癌miR-484的海绵

研究总结

通过对HCC进展期间circRNA谱的综合分析，该研究为肿瘤在circRNA水平上的异质性提供了新的认识。此外，该研究发现circADAMTS13在HCC肿瘤组织中特异性下调，并且可以通过有效地吸附miR-484作为HCC细胞生长的关键调控因子。因此，研究结果强调circADAMTS13可能对理解HCC进展的复杂分子机制和改进HCC治疗具有潜在价值。

参考文献 Liman Qiu, Yanbing Huang, Zhenli Li, et al. Circular RNA profiling identifies circADAMTS13 as a miR-484 sponge which suppresses cell proliferation in hepatocellular carcinoma [J]. Molecular Oncology, 2019, 441-455.