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越来越多的证据表明，单链环状RNA（circRNA）在包括肝细胞癌（HCC）的发生发展中起关键作用。但是，尚不清楚circRNA在HCC转移中起何种作用。在这项研究中，作者通过circRNA测序，确定了circASAP1，它与HCC患者根治性切除术后的肺转移有关。本文于2019年12月发表在Hepatology (IF:14.971)。

结果如下：

1、鉴定circASAP1参与了HCC转移和预后

对15例有肺转移和无肺转移的组织进行circRNA-seq，获得其差异表达的circRNA聚类热图和火山图（图1A-B）。其中最显著上调的包括circASAP1，其来源如图1C。qRT-PCR检测结果显示，三个circRNA中，只有circASAP1在转移性肺癌细胞系中显著高表达，且高表达circASAP1患者的总体生存期更短，复发率更高。总之，结果提示circASAP1参与了HCC转移和预后。

2、CircASAP1促进HCC转移和进展

如图2A-D所示，circASAP1过表达促进了HepG2和PLC/PRF/5细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。图2E和F显示，敲除circASAP1显著降低了小鼠的肝肿瘤和肺转移结节。以上说明circASAP1促进HCC转移和进展。

3、CircASAP1海绵吸附miR-326和miR-532-5p

作者采用RNA免疫沉淀法检测circASAP1与AGO2的结合，结果显示AGO2抗体可显著富集circASAP1(图3A)，说明circASAP1被纳入RNA诱导的沉默复合物中。使用circASAP1特异性探针进行circRNA下拉实验，qRT-PCR检测到18个miRNA的富集，其中miR-326和miR-532-5p的含量显著高于其它miRNA(图3B)。如图3C和D所示，circASAP1和miR-326，miR-532-5p之前确实存在结合，以及共定位。以上证实，circASAP1可通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p。

4、 CircASAP1通过海绵miR-326和miR-532-5p促进HCC转移和进展

作者实验发现，过表达miR-326或miR-532-5p可抑制HCCLM3细胞的增殖、迁移和侵袭能力，干扰其表达则相反。此外，抑制miR-326或miR-532-5p表达可以减轻circASAP1敲除引起的HCCLM3细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力下降(图4B)，相反地，过表达miR-326或miR-532-5p则可废止过表达circASAP1引起的生物学反应(图4A)。此外，小鼠体内模型实验具有相似的结果(图4C和4D)，提示circASAP1通过海绵miR-326和miR-532-5p促进HCC转移和进展。

5、在HCC细胞中circASAP1通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p提高CSF-1和MAPK1的表达

HCCLM3细胞中过表达miR-326或miR-532-5p均可显著降低CSF-1和MAPK1的mRNA和蛋白水平（图5A-D）。荧光素酶结果显示，miR-326和miR-532-5p均可显著抑制野生型3 -UTRs的CSF-1和MAPK1的荧光素酶活性，但对突变型则无影响(图5E)。此外，在HCC样本中，miR-326和miR-532-5p水平与CSF-1和MAPK1 mRNA表达呈显著负相关(图5F)。综上所述，在HCC细胞中，CSF-1和MAPK1是miR-326和miR-532-5p的直接靶点。

之后作者研究了circASAP1是否调控CSF-1和MAPK1的表达。qRT-PCR、western blot、ELISA结果显示，circASAP1过表达时，CSF-1、MAPK1表达升高，敲除circASAP1后，表达降低(图5G、5H、5I)。此外，miR-326和/或miR-532-5p的过表达显着逆转了circASAP1过表达诱导的CSF-1分泌和MAPK1表达增加；类似的，敲除miR-326和/或miR-532-5p则有相反的效果（图5J）。在肝癌组织中CSF-1和MAPK1的mRNA表达水平与circASAP1水平呈正相关（图5K）。以上结果表明，在HCC细胞中circASAP1通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p来增强CSF-1和MAPK1的表达。

6、CircASAP1通过调控miR-326/miR-532-5p-MAPK1信号轴来促进HCC细胞的增殖和侵袭

MAPK1又名ERK2，通过ERK1/2途径发挥其功能，是众所周知的肿瘤启动子在肝细胞癌中上调表达。作者发现ERK1/2抑制剂SCH772984在不影响总ERK1/2蛋白水平的情况下，以剂量依赖性的方式显著降低ERK1/2磷酸化水平(图6A)。此外，SCH772984能以剂量依赖的方式阻断circASAP1诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭(图6B和C)。这些结果表明，circASAP1通过调控MAPK1的表达，影响ERK1/2信号通路，促进HCC细胞的增殖和侵袭。

另一方面，作者发现circASAP1通过调节miR326/miR-532-5p-CSF-1信号来介导肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润(图6D和E)。circASAP1通过CM促进了巨噬细胞从PLC/PRF/5细胞的增殖和迁移，下调则效果相反(图6F和G)。小鼠模型试验显示下调miR326/miR-532-5缓解了因异种移植中circASAP1基因敲除诱导的TAM浸润；而过表达miR-326/miR-532-5p可消除circASAP1诱导的F4/80+ TAMs在PLC/PRF/5异种移植物中的浸润(图6H)。这些结果表明，circASAP1通过调控miR-326/miR-532-5p-CSF-1信号通路来促进TAM细胞的浸润。

7、CircASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs对HCC患者有预后价值

为了确定circASAP1、CSF-1、MAPK1和CD68+ TAMs在HCC中的临床意义，作者使用380例HCC原发肿瘤组织的组织芯片检测了这些因子的表达。图7A是典型案例图。circASAP1水平高的HCC肿瘤CSF-1和MAPK1表达水平高，TAM浸润增多（图7B）。高circASAP1表达水平患者的1年、3年和5年生存率显著低于circASAP1低表达水平患者，类似的，circASAP1高表达水平患者预后差，复发率高（图7C）。总之，circASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs对HCC患者有预后价值。

总之，本文所讲述的故事如图7D所示，CircASAP1在HCC中通常上调表达，circASAP1与miR-326/miR-532-5p结合，降低其丰度，进一步抑制其靶基因CSF-1、MAPK1的表达，其中MAPK1通过ERK1/2信号通路，促进HCC细胞的增殖和侵袭，CSF-1则促进TAM细胞的浸润。

参考文献：
Hu Zhi-Qiang., Zhou Shao-Lai., Li Jia., Zhou Zheng-Jun., Wang Peng-Cheng., Xin Hao-Yang., Mao Li., Luo Chu-Bin., Yu Song-Yang., Huang Xiao-Wu., Cao Ya., Jia Fan., Zhou Jian., (2019). Circular RNA Sequencing Identifies CircASAP1 as a Key Regulator in Hepatocellular Carcinoma Metastasis., Hepatology, undefined, undefined.