环状RNA简介

大多数的线性信使RNA（mRNA）在转录后都需要经过复杂的加工程序，如在5’端加m7G帽子和在3’端加Poly A的尾巴等。但是近年来，大量以环状构象存在的RNA被广泛研究，其为共价闭合的单链非编码RNA，没有帽子和尾巴的结构，由 mRNA前体通过反向剪接产生。因其闭合的结构避免了被外切核酸酶降解，大多数可以保持稳定的状态，半衰期为18.8-23.7h，而与它同源的线性RNA的半衰期为4.0-7.4h。

早在1976年，闭合环状结构的基因组就被发现，但是因为其数量少且表达量低，所以环状RNA一直被认为是剪接中产生的副产物，不具备生物学功能。随着高通量测序技术的发展，这种不带Poly A尾巴的神秘结构也被慢慢地探索发现。它们通过不同的分子机制参与细胞各个层面的基因表达调控，在生理及不同病理条件下都具有重要的作用。如通过转录或转录后的方式调节基因表达；影响亲本基因的选择性剪接；形成环形RNA蛋白质复合体调控信号通路；作为miRNA的分子海绵调控下游靶基因的表达水平；在某些条件下可以被翻译成多肽或蛋白质等等的作用。

应用

环状 RNA 在构象、稳定性和免疫原性方面不同于线性 RNA，这一特殊性使许多人尝试开发基于环状RNA的技术。包括使用环状 RNA 作为非编码适配体来干扰细胞内过程、调节先天免疫反应、抑制与疾病相关的 miRNA 和蛋白质，并用作反义 RNA 和翻译的模板，以及作为治疗的靶点和标志物。最近，北京大学的魏文胜教授团队开发了一种新型的环状RNA疫苗，该疫苗通过表达S蛋白的三聚体 RBD 区域在小鼠和恒河猴体内引发了有效的中和抗体和 T 细胞反应；还分别针对德尔塔和奥密克戎研发了两种不同的疫苗，结果显示针对德尔塔的疫苗具有更大的广谱性。该成果揭示了环状RNA有潜力成为新型的疫苗和治疗平台，一经发表就引发了大家的广泛关注和讨论。

图1 环状RNA疫苗可在小鼠和恒河猴体内提供对新冠变异毒株的有效保护

环状RNA作为一种先进的技术，大家对其产业化的道路和成果也充满了期待。在此，笔者想要浅谈该工艺路线，如有不足之处，欢迎一起探讨。

环状RNA工艺

① 技术要点：RNA环化和表达

在体外合成环状RNA的过程中，环化这一步是我们绕不开的一个槛。目前的有三种常用的环化方法：I型内含子自剪切、Ⅱ型内含子自剪切和T4 RNA连接酶等方法。I型内含子剪切最重要的特点是自我催化，活性依赖于RNA分子中的碱基配对。其中发生了三次的转酯反应，第一次是由一个游离的鸟苷或者鸟苷酸（GMP、GDP、GTP）启动的。Ⅱ型内含子多存在于线粒体中，剪切由内部的腺苷酸引起，之后形成套索结构。T4RNA连接酶可以催化5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键，可用于RNA分子间和分子内的连接，也可用于DNA和RNA之间的连接，在形成环状RNA时，对于＜1000nt的连接更有效率。

在某些特殊条件下，环状RNA具有被翻译成蛋白质的功能，目前报道的有内部核糖体进入位点（IRES）和N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰等都可以启动翻译。IRES 是一个长为数百个碱基对的基因工程元件，最早在脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒中被发现，可直接招募核糖体的 40S 亚基，启动 3’方向 ORF 的翻译。RNA 的 m6A 修饰是在 RNA 分子 A 碱基的第六位 N 元素上加上一个甲基基团，m6A 结合蛋白 YTHDF3 和真核翻译起始因子eIF4G2 的相互作用，将后者招募到含有 m6A 修饰的circRNA，进一步招募 43S 复合物。

② 环状RNA的检测方式

如何确认合成的环状RNA，并将他们与线性RNA进行区分是在工艺中需要重点考虑的事情。Sanger测序结合RT-PCR和Northern Blotting (NB)是目前使用比较多的方式。在变性胶图中，环状 RNA 比具有相同序列的线性 RNA 迁移得更慢，我们可以以此来对这两者进行区分。

③ 环状RNA的产业化流程

环状RNA的科研级别的制备技术相对已经成熟，如何进行产业化也成为了业内需要共同跨越的一个难题。我们尝试将其分为两个大的工艺模块，分别是质粒的制备和环状RNA的制备。

质粒DNA（pDNA）是环状RNA生产中不可或缺的原料，可以用作体外转录的模板。质粒的工业化生产工艺目前已经趋于成熟，可选择外包或者建立平台内部开发，收获一定规模的高纯度超螺旋质粒。需要去除产品相关杂质和工艺相关杂质，控制生物负荷，进行稳健和可全面放大的操作。整体工艺过程包括发酵、菌体收获、碱裂解、澄清、超滤浓缩、层析等步骤，如下图所示。层析步骤中包含了经典的三步纯化，第一步用的填料是一款分子筛的填料Sepharose 6FF，用来除去RNA；第二步是一款为Capto PlasmidSelect嗜硫亲和填料，可以用来分离超螺旋的质粒；第三步是一步阴离子交换层析，用的填料是Capto Q ImpRes，用来去除痕量杂质和内毒素。该工艺经过客户的多年验证，得到普遍认可，是高效、通用、稳健的平台化工艺路线。

图2 质粒的工艺流程图

拿到高纯度质粒后，就可以着手制备环状RNA 了。整体工艺可以分为质粒线性化及纯化、体外转录、DNase I去除DNA模板、RNA环化、层析纯化、RNaseR处理、再层析纯化、制剂等步骤，如下图所示：

图3 环状RNA工艺流程图

拿到高质量的质粒以后，第一步需要用限制性内切酶 Bsa I将质粒进行线性化的处理，反应完成之后，可以用层析的方式除掉反应的酶，并将缓冲液置换成后续适合IVT反应的溶液。该步骤和线性mRNA的处理过程是一致的，其目的都是为了得到线性化的质粒以利于后续的IVT和环化。

第二步就来到了IVT的环节，为了在体外得到RNA，大部分的工艺会选择使用T7 RNA聚合酶进行体外转录，得到单链RNA，反应结束后，使用 DNase I去除 DNA 模板，减少对后续反应的影响。

第三步也是环状RNA制备过程中非常重要的一步，即环化过程。如前所述，RNA的环化有三种不同的方式，不同的方式、不同的RNA长度都可能带来不同的环化效率，也是我们在工艺过程中需要重点摸索的一步，环化效率越高，后续的纯化方式就可以越简单。环化完成后，必然伴随着副产物，如T4RNA连接酶或者环化使用的GTP，Linear precursor以及Nicked RNA，这些都是我们要去除的杂质，所以环化以后，使用层析的方式对目的产物进行纯化，便于后续工艺的放大。层析结束后，继续使用RNase R处理，它是一种来源于大肠杆菌 RNR 超家族的 3’-5’核糖核酸外切酶， RNase R 可消化几乎所有的线性 RNA 分子，但不易消化环形RNA，所以经常用于环形 RNA的富集过程。接着继续使用层析，去除还残留的一些小片段的线性RNA和酶，使产品达到一定的纯度。层析所使用的填料，可以根据要去除杂质和目的之间的性质差异来选择，Cytiva可提供多种类型层析填料，如分子筛、Capto Core系列、离子交换、亲和填料等等。

第四步，就进入制剂环节，可以通过超滤的方式将原液置换到合适的缓冲液中。在这些工艺步骤中，从质粒到环状RNA，从实验室级别的工艺开发，到GMP级别的生产放大，Cytiva可提供全流程的一站式解决方案，助力行业快速发展。

以上的工艺流程，可以供大家讨论和参考，环状RNA的研发和产业化道路还存在诸多的挑战，我们希望建立一个简单、快速、可重复、可放大的高效生产环状RNA的工艺平台，加速这一非凡疗法的产业化之路

这是“环状RNA社区”的图片