环状RNA几种翻译模式,初步可将真核生物环状RNA翻译归类为：

1. 内部核糖体进入位点（IRES）介导的翻译

2. 非IRES介导的翻译：

滚环扩增翻译（RCA）
由UTR或其他翻译激活原件诱导的翻译
m6A修饰后的翻译

今天来给大家介绍一下如何构建minigene表达系统。minigene表达系统能够在真核细胞中有效的生成目的环状RNA，进而通过IRES的介导表达目标蛋白。这种minigene表达系统是研究环状RNA生成机制和翻译功能的重要工具。

小知识

我们知道，真核生物mRNA的整个翻译过程包括起始、延伸和终止3个阶段。起始阶段一般指核糖体识别起始密码子（AUG），是翻译调控的关键。起始阶段可分为两种方式：扫描模型和内部起始模型。

扫描模型中翻译起始因子与Kozak序列结合，使核糖体与5’末端帽子结合，然后沿着mRNA扫描直至AUG；而内部起始模型绕过5’末端帽子，通过IRES元件，使核糖体结合到mRNA的内部区域，即直接结合到AUG或其上游，进而起始翻译过程。

内部核糖体进入位点（IRES）具备募集核糖体并实现核糖体组装和后续阅读框蛋白编码的功能。此外，IRES也能够与核糖体RNA形成碱基对，类似于在细菌翻译起始的Shine-Dalgarno序列。因此，IRES作为一种翻译元件在研究蛋白编码过程中发挥着重要的作用。

研究目的

通过构建特定的含有IRES和GFP开放阅读框（ORF）的minigene表达系统，研究反向剪切成环的机制和效率；进一步观察形成的环状RNA能否有效表达目的蛋白。

研究思路

研究者构建了含有单外显子（两端是哺乳动物剪切位点AG-GT）的minigene，GFP的ORF序列分开成两部分，反向排列，研究能否在经典的剪接位点成环；并且将IRES插入到起始密码子的上游，用来检测生成的环状RNA的翻译功能（图1A）。

为了验证minigene两侧的Alu序列在成环中的作用，分别构建两种minigene:相同的上游序列和不同的下游序列，分别形成配对和不能配对的dsRNA结构（图1A）。

Western blot和免疫荧光实验检测minigene生成的环状RNA蛋白表达情况，并且进一步研究PolyA结构对翻译过程的影响。

研究结果

1/minigene促进环状RNA形成

研究者检测到两种minigene在细胞转染1天后就有环状RNA生成，在3-4天时达到最高值。minigene两侧互补对环状RNA的形成有明显的促进作用，大约提高10-30倍的效率（图1B）。但是这种能够形成dsRNA结构的配对序列不是形成环状RNA所必须的。将5’剪切位点突变后（GT→CT），反向剪切没有发生，环状RNA则不能形成（图1C）。

2/验证反向成环的发生/

为了验证环状RNA的保守性，研究者又将含人类内含子的minigene转染到果蝇S2细胞中，发现同样能够有效的反向剪切生成环状RNA，预示这种机制在脊椎和无脊椎动物中可能存在保守性（图1D）。

图1 反向剪切生成环状RNA

A: Minigene示意图：GFP蛋白分开位于外显子两端；转录由CMV promoter驱动，由SV40 PA终止；构建了可以内含子配对和不能配对的两种minigene；

B:  转染293T细胞后1-5天的总RNA纯化，再分别用RNase R处理和不处理，设计不同引物的RT-PCR检测Minigene转录生成的RNA；并且研究环状RNA占总RNA的比例；

C:  将minigene剪切位点突变后，观察RNA的形成情况；

D: 果蝇S2细胞中的环状RNA形成情况。

３/环状RNA的表达研究/

研究者发现内含子配对/不配对的minigene转染细胞后能够稳定表达GFP蛋白，表明环状RNA能够和线性mRNA一样，在真核细胞内直接着编码蛋白。此外，5’剪切端突变后，蛋白编码能力消失（图3A）。

为了证实表达GFP蛋白全部来自环状RNA，研究者在质粒backbone部分引入两个酶切位点消化，排除转录过程中小几率生成的含有整个ORF的长RNA。利用ApaLI或者ApaL1/MluI消化质粒，转入细胞后，RT-PCR和Western blot显示检测到环状RNA和表达的GFP蛋白（图3B）。

流式细胞实验显示转染2天后，大约有25%的细胞表达GFP蛋白（图3C），推测可能和瞬时转染效率，环状RNA生成和蛋白合成速度较慢等综合因素有关。免疫荧光实验显示，在稳定转染体系中几乎所有细胞都有GFP蛋白表达（图3D）。

minigene插入poly(A40)、poly(T40)后，GFP蛋白表达水平降低，这一结果和真核生物线性mRNA翻译的情况不同。研究者推测在IRES上游插入重复序列，会对IRES介导的翻译产生干扰和抑制作用（图3E）。

图3 实验检测环状RNA在真核细胞中翻译GFP蛋白情况

A:   Western blot检测野生型和两种剪切位点突变型minigene转染细胞中的GFP蛋白；
B:   RT-PCR和Western blot检测单酶切消化minigene后转染细胞中的环状RNA和GFP蛋白；
C:   流式细胞技术检测表达GFP蛋白的细胞；
D:   免疫荧光实验检测表达GFP蛋白的细胞；
E:   RT-PCR和Western blot检测minigene插入poly (A40)，poly (T40)，转染细胞后的环状RNA和GFP蛋白。

小结
要想构建特定minigene，在人类和果蝇细胞内有效成环和表达需要考虑以下几点：

1>    5′剪切位点（5′ ss）and 3′ ss遵循GT-AG规律，5′ ss突变后，反向剪切不能发生，不能形成特定环状RNA。

2>    minigene两侧的能够互补配对的Alu序列对反向剪切有促进作用，但不是必须的。

3>      一般都要用RNase和剪切位点突变处理，对比前后的环状RNA情况差异，验证反向剪切成环的发生。

4>     为了研究环状RNA的表达，需要插入目的蛋白ORF和翻译启动元件IRES，并且将ORF分开，保证成环后才能行使功能，排除线性RNA蛋白表达的可能性。

5>      与线性mRNA翻译不同，PolyA结构序列对翻译的效率没有明显的作用。

好了，我们已经介绍了两种环状RNA的表达情况，以及构建表达系统的基本因素，后续将继续介绍真核生物内源性环状RNA的翻译情况。

参考文献：

[1] Wang Y, Wang Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA 2015; 21:172–179.