作者：耀海生物

y前言环状RNA (circRNA)是一类单链闭合的环状RNA分子，由mRNA前体（pre-mRNA）通过可变剪接（AS, Alternative Splicing），外显子环化或内含子环化）产生，内源性环状RNA包括编码或非编码性RNA，不包含5'端帽结构和3'端poly(A)，缺乏游离末端，因此不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。20世纪70年代，研究者在植物类病毒中首次发现circRNA，随后在多种病毒、小鼠和人类等真核细胞内发现circRNA的存在。随着生物信息学和测序技术的发展，研究人员检测到circRNA在真核细胞中广泛存在，circRNA的调控和编码功能也逐渐被深入研究。接下来，菌菌将围绕circRNA的发展史、基础研究和治疗应用展开阐述。

一、circRNA的发展史

如下图所示，1976年，有学者在植物类病毒中首次发现单链闭合的circRNA。1979年，借助电子显微镜可观察到真核细胞质中存在circRNA。随后的几年，研究者先后在人丁型肝炎病毒和人体细胞中鉴定了circRNA，并发现circRNA不易被RNA外切酶降解，结构较稳定。1995年，研究报道在内部核糖体进入位点（IRES）的助力下，可实现工程化circRNA的异源表达。2010年至2015年期间，有研究报道了circRNA在代谢性疾病和肿瘤相关通路中发挥一定的调控作用，且发现了circRNA作为miRNA海绵的功能。直至2017年，circRNA可编码蛋白质的功能在多篇文章中报道。

图1 环状RNA的发展史

二、环状RNA(circRNA)的基础研究

1.环状RNA的形成方式经典的线性RNA剪接方式（Spicing），通过识别内含子中的5’端剪接位点（GU）和3’端剪接位点（AG），将前后外显子首尾相连，剪接产物为成熟的mRNA，具有5’端帽结构和3’PolyA尾。而环状RNA剪接方式为Back-spicing，通过特异性反向剪接，后面外显子的尾端与前面外显子的前端相连，产生的circRNA没有5’端帽结构和3’端PolyA尾，由一个或者多个外显子构成,部分circRNA也包含内含子。

图2 环状RNA的剪接示意图

2.环状RNA的分类

根据circRNA序列来源，可以把circRNA分为四类：①EciRNA（Exonic circRNA）是来源于母基因外显子的circRNA；② ciRNA（Intronic circRNA）是来源于内含子的套索型circRNA；③ EIciRNA（Exon-intron circRNA）是来源于外显子和内含子的circRNA；④ Antisense circular RNA是来源于反义链转录本的反义circRNA，Intergenic circular是来源于基因间序列或其他未注释基因组序列的circRNA。

绝大多数的circRNA属于外显子类型的circRNA，保守性较其他种类的circRNA也更高。

3.环状RNA的主要生物学功能

circRNA的调控作用：circRNA可与亲本DNA基因座、miRNA、mRNA或蛋白质结合，调控基因的表达和信号通路。除调控作用外，circRNA也可作为蛋白翻译的模板，借助IRES、m6A和其他序列元件启动蛋白的翻译，包括内源或外源性蛋白。其生物学功能详细介绍如下：

调控转录与剪接：例如，ci-ankrd52与亲本基因座结合，形成R-loop，激活RNase H1介导ci-ankrd52酶切，破坏R-loop，促进转录延伸。circSEP3与亲本的DNA基因座形成R-loop，导致转录暂停，产生外显子跳跃突变体。

蛋白海绵：circMbl与MBL蛋白的反馈调控，MBL可结合在circMbl内含子的侧端，促进circMbl的合成；同时高表达的circMbl会吸附MBL蛋白，影响MBL靶向其他通路的功能。

调控免疫：部分circRNA会形成较短的dsRNA区域，可结合并抑制细胞中dsRNA活化蛋白激酶R（PKR），调控免疫反应。

circRNA与蛋白质结合形成RNA-蛋白复合体，调节信号通路。

miRNA海绵：含有多个miRNA结合位点，可作为竞争性内源性RNAs（ceRNAs），吸附miRNA，从而调节miRNA对靶mRNA的作用。

与mRNAs相互作用：circRNA可以与mRNA结合，影响mRNA的稳定性和翻译。

与蛋白结合：circRNAs与蛋白质的结合能力强于线性mRNA，从而影响mRNA的翻译，发挥竞争性结合的功能。

作为多肽或蛋白质的翻译模板：除调节基因表达的非编码作用外，circRNA以非帽结构依赖的方式，借助于IRES启动蛋白质的翻译，circRNA的甲基化修饰m6A也可以驱动circRNA翻译合成蛋白质，circRNA还可以利用其他的序列元件（如：IRES-like elements）来启动翻译。

图3 内源或外源性环状RNA的翻译功能

三、环状RNA(circRNA)的治疗应用

1.环状RNA用于基因的调控（非编码功能）

circRNA的结构、稳定性和免疫原性不同于线性RNA，人们尝试开发基于circRNA的生物技术，基于circRNA的特性，其在生物医学的潜在应用包括：

• circRNA适配体可以招募荧光传感器和有效代谢物生物传感器。
• circRNA作为miRNA海绵，竞争性吸附miRNA，阻断其对mRNA的抑制。
• 合成包含目标蛋白反应元件的circRNA，作为蛋白海绵调节蛋白的活性。
• 反义修饰的circRNA靶向病毒基因组的保守区域，可阻断病毒的传播；或靶向mRNA募集ADAR进行RNA编辑。
• 自剪接产生的circRNA促进细胞内RIG-I表达和PKR激活，诱导先天性免疫级联。
• 含有短dsRNA区域的circRNA无细胞免疫原性，是参与内在免疫反应的PKR的有效抑制剂。
• circRNA的产生具有组织特异性，靶向病理或疾病相关的circRNA可作为疾病诊断的生物标志物。

2.环状RNA作为蛋白的翻译模板（编码功能）基于circRNA的结构稳定性、低免疫原性与蛋白翻译功能，circRNA代表了一种新的基因表达平台，可作为mRNA药物的增强或替代。研究人员可通过适当的序列设计和体外制备，编码任何感兴趣的蛋白。2022年3月，北大魏文胜课题组在《Cell》发表研究性论文：Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants。作者基于环状RNA（circRNA）疫苗平台，选择刺突蛋白（spike protein, S蛋白）的受体结合域（RBD, receptor-binding domain）三聚体作为目标抗原，经序列设计、模板制备、体外转录（IVT）、环化、纯化后得到高度稳定的circRNA，并成功地在小鼠和恒河猴中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和特异性免疫反应。研究还尝试利用circRNA技术，编码SARS-CoV-2特异性抗体或hACE2诱饵（病毒受体），验证了这一策略可有效中和SARS-CoV-2假病毒。

图4 circRNA的序列设计（编码新冠S蛋白RBD三聚体）

除表达病毒抗原或病毒受体外，circRNA平台可通过在体内编码治疗性抗体，如PD1/PD-L1抗体，发挥抑制肿瘤的功能。与抗体和蛋白类药物相比，circRNA药物具有以下优势：可在细胞质编码治疗性抗体，且能绕过细胞膜屏障靶向细胞内靶点，如TP53和KRAS。

四、结语

如Laronde公司所言，circRNA是一种新的“程序化药物”，其潜能无限，可在体内表达任何治疗性蛋白，可能会取代或增强现有的药物使用模式。由于独特的优势，环状RNA(circRNA)吸引了生物公司的布局。据公开资料显示，国内外几家公司加入了circRNA治疗平台的开发队列，包括Orna Therapeutics、Laronde、圆因生物和环码生物。国内药物合同研发（CRO）公司有耀海生物、吉赛生物。从产品管线来看大多基于circRNA的蛋白编码功能，利用Ⅰ/Ⅱ型内含子的自剪接或T4连接酶实现RNA的体外环化，可编码蛋白包括新冠S蛋白、CD19嵌合抗原受体、肌养蛋白，涵盖传染病、肿瘤和遗传病领域。日前，默沙东与Orna Therapeutics宣布了一项合作协议，基于Orna环状RNA平台，共同开发多款疫苗和治疗性药物，Orna可获得高达35亿美元的里程碑款项。此外，默沙东将在Orna的B轮融资中投资1亿美元的股权。Laronde、圆因生物和环码生物也受到资本的青睐，获得高额融资。对比国内外环状RNA领域的企业，大家差距并不遥远，相信在不远的将来，环状RNA技术将成为科研与工业领域的热门，建立一种全新的药物平台。作为CXO相关企业，菌菌希望能贡献一己之力，助力环状RNA早日实现产业化，期待相关科研成果尽快步入临床。

参考文献

[1] Liu CX, Chen LL. Circular RNAs: Characterization, cellular roles, and applications. Cell. 2022 Jun 9;185(12):2016-2034. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.021.

[2] Qu S, Liu Z, Yang X,et al. The emerging functions and roles of circular RNAs in cancer. Cancer Lett. 2018 Feb 1;414:301-309. doi: 10.1016/j.canlet.2017.11.022.

[3] Yang L, Wilusz JE, Chen LL. Biogenesis and Regulatory Roles of Circular RNAs. Annu Rev Cell Dev Biol. 2022 May 24. doi: 10.1146/annurev-cellbio-120420-125117.

[4] Qu L, Yi Z, Shen Y, et al. Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants. Cell. 2022 May 12;185(10):1728-1744.e16. doi: 10.1016/j.cell.2022.03.044.