上片文章我们介绍了构建特定minigene表达系统，能够在真核生物细胞中生成目的环状RNA，进而表达目标蛋白。这种方法对研究单个环状RNA翻译有重要的作用，但不能对组学数据进行高效的研究。

那么面对NGS发现的大量内源性环状RNA，如何确定它们是否具有蛋白编码功能？今天主要通过一篇文章，总结一下文章中的研究思路，我们可以借鉴一下文中运用的生物信息学和功能学方法。

这是2017年的一篇发表在cell子刊的文章[1]，《Nature Reviews Genetics》也对其进行了亮点介绍[2]，认为该文章通过一系列体内和体外实验，有力地证明了果蝇内源性环状RNA具有编码蛋白的能力，并且在小鼠中也有类似的发现，拓宽了我们对内源性环状RNA功能的认识。

研究背景和目的
通过测序发现果蝇中含有大量内源性环状RNA，其中大多数来源于蛋白编码基因，并且含有完整的外显子序列[3]。作者对这些环状RNA是否具有翻译功能进行研究。

研究方法和结果
研究者从多个方面验证内源性环状RNA的翻译功能，主要有以下几点：

1.通过生物信息学发现与翻译核糖体相关的环状RNA

作者首先对已有CircRNAs测序数据进行分析，利用cORF_pipeline程序对CircRNAs的ORF（cORFs）进行预测、筛选和注释。将反向剪切位点（backsplices）进行标记并作为参考。

其次通过果蝇已有核糖体印记（RFP）数据进行CircRNAs挖掘，比对上述参考的反向剪切位点，最后找到含有cORFs，并且与核糖体结合的37个候选CircRNAs，推测这些核糖体相关的环状RNA（ribo-circRNAs）具有蛋白编码的能力（图1）。

图1  A.生信流程挖掘ribo-circRNAs；B.果蝇细胞RFP数据中ribo-circRNAs

2.通过核糖体印记（RFP）发现circMbl有翻译的潜力

为了验证环状RNA的翻译在不同细胞和组织中具有普遍性，研究者对果蝇脑部组织进行了RFP测序分析，发现了122种ribo-circRNAs，其中有7种与果蝇S2和Kc细胞有交集，并且发现丰度最高的circMbl（图2）。

图2 果蝇头部RFP测序分析

3.发现circMbl表达环状RNA特有的肽段

首先，根据线性MBL，计算各种线性isoform表达蛋白的分子量；同时推测线性MBL形成circMbl的几种类型，计算各种线性isoform表达蛋白的分子量（图3）。

图3 线性Mbl和circMbl各自isoform表达蛋白分子量的计算

其次，通过实时质谱监测蛋白水解生成的circMbl3肽段和IP技术富集的线性MBL肽段，结果显示circMbl3肽段为37.02KDa，为环状特有的肽段RAADTTDMFPLIM（图4）。

图4 质谱检测circMbl3表达特有的RAADTTDMFPLIM肽段

4.构建特定的minigene，细胞内表达目的蛋白

研究者筛选了3种ribo-circRNAs（circMbl, circCdi和circPde8）作为研究对象，用2种非RFP circRNAs（circHaspin和circCamK1）作为阴性对照。分别构建相关minigene，以V5-tagged蛋白作为成环的标记。感染果蝇细胞后，检测到相关蛋白的表达（图5B）。

图5  A.minigene示意图；B.minigene在果蝇细胞中表达蛋白

5.发现类似IRES功能的序列，起始环状RNA的翻译

研究者构建三种circRNA reporters：正向（circMbl cUTR），反向cUTR型（RevcUTR）和cUTR缺失型（∆cUTR）。以线性reporters作为对照在体外表达系统中进行试验，结果显示：含有cUTR的报告基因renilla荧光表达量低于含IRES的2倍，但高于RevcUTR，而cUTR缺失后终止翻译活力。说明cUTR有类似IRES的功能，但是翻译效率较低（图6）。

图6 三种报告基因在体外表达系统中翻译能力

研究总结
本文验证方法比较系统，技术手段比较丰富，我们可以对这些方法进行选择，应用到今后的研究中。一般来说有以下几点，可以说明具有翻译能力：

1>在拿到高通量环状RNA的测序数据后，可以用生物信息学的方法对ORF进行预测和筛选；

2>用核糖体印记测序方法或者蔗糖密度梯度离心功能学实验证明所测circRNAs与核糖体结合，说明有翻译潜力；

3>构建minigene或者reporter在体内和体外验证候选circRNAs的表达；

4>找到IRES或者其他翻译起始序列，进一步说明翻译的理论科学性；

5>此外，要有体内核糖体质谱，IP，TRAP等其他实验能够更好地进行验证。

参考文献：
[1] Pamudurti NR et al., Translation of circRNAs. Mol Cell 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2017.02.021
[2] Koch L. Translated circular RNAs. Nature Reviews Genetics 2017; doi:10.1038/nrg.2017.27
[3] Westholm JO, Miura P. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Rep 2014; 9, 1966–1980.文章来源：基迪奥生物