与DNA甲基化一样，科研工作者对RNA甲基化研究也经历了相当长的时间。高通量技术的普及推动了表观转录组学（Epitranscriptomes）的发展，并使其成为新的研究热点。RNA甲基化主要包括N6-methyladenosine（m6A），5-methylcytidine（m5C）和ribose methylations。

 

m6A修饰参与调控了RNA许多重要生物学功能，包括肥胖、神经突触信号传递、肿瘤、生殖发育等；在分子层面，m6A修饰主要参与调控RNA-蛋白相互作用，RNA二级结构稳定性，RNA剪接，翻译调控等。在细胞内，m6A修饰主要由YTH domain家族蛋白识别，包括YTHDF1，YTHDF12和YTHDF13。

 

除了线性mRNA存在甲基化修饰外，最近研究表明环状RNA也同样受到甲基化的修饰，并具有一定的特点[1,2]。本周解读一篇文章，研究环状RNA甲基化以及对蛋白翻译的调控，我们可以借鉴其中的高通量测序和生物信息学方法。

 

研究背景

 

本文作者在2015年报道含有Internal ribosomal entry site（IRES）的circRNAs能够在真核细胞内编码蛋白（戳这里查看~）。接着偶然发现不含IRES的阴性对照组circRNAs也能在人类细胞中翻译，预示着可能还有其他机制调控着环状RNA翻译。

 

研究思路和结果

 

作者利用多种方法研究环状RNA甲基化和翻译机制，主要包括：

 

1. 发现候选circRNAs的共有序列特征，推测甲基化驱动翻译

 

作者对不含IRES的circRNAs的翻译起始位点附近序列进行序列比对，在起始密码子附近都发现有RRACH片段（R= G or A; H = A, C or U），能够被m6A修饰，简称（RRACH motif）。作者推测RRACH片段的m6A修饰驱动了circRNAs的5’帽子非依赖性的翻译（图1）。

图1 发现共有的m6A motif (GAACC/A)

再通过circRNA reporters验证以上推测，发现一个或两个m6A motifs（GGACU）都能够驱动翻译，且翻译效率相似。此外，m6A motifs突变后，翻译效率显著下降（图2）。因此作者推论不含IRES的circRNAs的翻译需要甲基化诱导。

图2 分别插入突变motif、1、2个RRACH motif时circRNA翻译情况

 

基于上述推论，作者通过甲基化环状测序circRNA-m6A-seq（m6A-IP富集的环状测序），筛选甲基化修饰的内源性circRNAs，再利用生物信息学筛选含有长ORF（≥150 nt）具有翻译潜力的circRNAs。

图3 甲基化环状测序和筛选翻译潜力的circRNAs

 

3. Polysome表达谱验证候选circRNAs与核糖体相关

 

Polysome表达谱根据结合核糖体数目，将多核糖体组进行分离，然后研究与其结合的RNA。通过翻译组学的技术，结合circRNA生信流程，检测上述筛选的25个circRNAs是否与Polysome结合。结果显示有10个circRNA与Polysome结合，显示出翻译的潜力。

图4 多核糖体表达谱原理和相关circRNA的检测

 4. 分析已发表数据，比较环状和线性RNA甲基化情况

 

通过对数据库中人源细胞CLIP-seq dataset（ENCODE）、m6A profiles [3]、翻译起始位点图谱（TIS）[4]进行分析，计算线性和环状RNA与甲基化相关基因（eIF4G2，eIF3A /eIF4G1）的结合频率等参数。结果发现，线性与elF家族结合频率较高。然而，含有m6A和TIS环状RNA与elF家族结合频率比线性RNA高。说明eIF家族偏好性结合环状RNA的m6A和TIS位点，可能驱动环状RNA的eIF4G2依赖性翻译。

图5 生物信息学分析m6A测序，TIS图谱数据

此外，作者还构建表达系统证实eIF4家族参与了翻译调控，通过质谱技术验证circRNAs特有的蛋白等方法，这里就不详述这些功能学方法了。

1. circRNA的表观转录组学是将RNA甲基化建库测序与circRNA的生信分析结合，比较依赖于免疫IP实验的RNA富集建库；

2. circRNA的翻译组学是将核糖体印记（RFP）或者Polysome 表达谱技术与circRNA预测结合，同样依赖于核糖体分离，RNA的富集。总之，富集实验的效果与circRNA的种类和丰度是该研究的关键因素。