在多组学研究过程中，处理组和对照组的对比所发现的差异RNA往往有很多。此外，生物学过程是时空动态的，某一时间点差异显著的RNA不一定是最相关的。如何提高筛选效率？

由于mRNA，lncRNA和环状RNA上存在miRNA反应元件（MRE），都可以结合miRNA，从而能够互相影响称为内源竞争性RNA（ceRNA）效应。利用多组学能够将mRNA和其它种类RNA分子关联起来，有助于深入了解某一生物学过程中复杂的分子机理。但是ceRNA也是有条件的，如何准确找到参与ceRNA的相关基因？

今天我们来解读一篇文献，看看作者如何利用多组学，结合不同的时间点的趋势分析来缩小筛选范围，同时依据靶向位点数量预测，找到关键性的miRNA，最后阐释生物学过程中存在的ceRNA分子机理。

发表期刊：《Nucleic Acids Research》

影响因子：9.202

研究目的：利用多组学综合研究化学物质BaP致癌过程的分子机理。

研究思路：化学致癌物BaP和对照DMSO处理细胞（6个时间点2个重复），分别进行去核糖体RNA-Seq和small RNA-Seq，筛选出侯选mRNA、miRNA和circRNA，通过靶向关系研究将三者关联起来。

研究结果：高通量测序筛选差异基因

得到raw data后，根据TMM（trimmed mean of M-values）进行归一化处理，统计不同时间点，处理组（BaP）和对照组（DMSO）HepG2细胞中的差异表达基因（Fold change ≥ 1.5；FDR ≤ 0.05），结果显示（表1）：

表1 不同时间点，处理组和对照组差异表达的mRNA，circRNA和miRNA

A:  1143个差异表达的mRNA，其中多数显著富集于生物学功能“cellular response to xenobiotic stimulus”（GO: 0071466），与化学毒理和致癌相关的基因CYP1A1，ALDH3A1，AKR1B10等；DNA损伤和修复相关的基因MDM2，CDKN1A，CCND2，SFN，MGMT，RAD51B等；

B:  163个差异表达的circRNAs；

C:  16个差异表达的miRNA，包括唯一所有时间点都高表达的miR-181a-1 3p（受到BaP处理影响），此外还有miR181家族，miR-122和miR19家族的一些分子。还包括所有样本丰度最高的mir-192 5p，mir-21 5p和mir-191 5p（不受BaP处理影响）。

因此，每个时间，处理和对照组中的差异mRNA和circRNA比较多，不利于精确筛选最关键的基因；虽然，差异表达的miRNA相对较少，但是其靶基因也可能有很多。

不同时间点趋势分析

利用STEM（Short Time-series Expression Miner）函数对不同时间点基因的表达趋势进行研究，观察mRNA、miRNA和circRNA是否存在一定的表达趋势。

• GO: 0071466中大多数差异mRNA（512个）表达比较稳定，只在24h时丰度达到一个峰值，可能与BaP代谢过程有关。
• 虽然每个时间点都有一些circRNAs差异表达，但是没有一个circRNA在所有时间点持续表达。

因此，从mRNA和circRNA的角度入手难度相对较大，而差异表达的miRNA数量较少，作者把目标锁定到miRNA上，其中miR-181a-1 3p表达量在所有时间点持续高表达，于是作者推测miR-181a-1 3p是关键的基因（图1）。

靶向关系预测

为了进一步筛选参与ceRNA的相关基因，作用利用miRanda分析差异miRNA与所有表达的mRNA和circRNA的靶向关系，结果发现在所有差异miRNA中，miR-181a-1 3p的靶基因数量最少（328个基因的3’UTR）。其中14个是差异表达mRNA，其中包括DNA修复相关的抑癌基因MGMT，在24h时表达量受到抑制（图2）。同时发现16个差异circRNA能与miR-181a-1 3p结合。

图2 miR-181a-1 3p靶基因MGMT表达趋势

分子机理推测

综合上述结果，作者推测，BaP诱导miR-181a-1 3p高表达，抑制了MGMT的丰度，导致了癌症发生；24h后，miR-181a-1 3p表达降低以及被circRNAs的数量增加竞争性结合，MGMT表达又上升，降低了突变的速度。

研究总结

1. 关于提高筛选精度：

首先，多组学数据可以建立相关性，缩小目标范围；其次，作为ceRNA的桥梁作用，miRNA是研究的关键。本文中发现差异表达的miRNA数量比mRNA和circRNA要少，所以作者容易从miRNA中找到突破。最后，在加入不同时间点后，可以通过趋势分析进一步缩小miRNA筛选的范围。

2. 关于ceRNA：

一般miRNA的靶基因数量较少，单个靶基因的表达量变化，才会引起其他靶基因比较显著的变化。反之ceRNA效应不明显；miRNA自身丰度的变化能促进ceRNA的效应。一些circRNA对miRNA的吸附能力也很强，因此参与ceRNA效应的概率也可能较大，是很有研究潜力的。

参考文献：【1】Caiment F, Gaj S, Claessen S, et al. High-throughput data integration of RNA–miRNA–circRNA reveals novel insights into mechanisms of benzo[a]pyrene-induced carcinogenicity[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5):2525-34.

解读：基迪奥生物