环状RNA作为一种新型RNA分子，参与调控癌症等多种疾病，已经成为新的研究热点。外泌体（exosome）存在于人体各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，包含细胞特异的蛋白、脂质和核酸可以作为疾病诊断的标记。外泌体样本收集方便，也是目前临床医学研究的热点。两者都是医学研究中的“新宠”，外泌体中的环状RNA相关研究则更少，自然也逐渐受到研究者的关注。

今天我们通过一篇文献，总结下研究外泌体中的环状RNA需要注意哪些问题[1]。例如外泌体中环状RNA数量、丰度和生物学重复性、外泌体分离提取和鉴定、高通量建库和测序等问题。

研究背景：在2015年Bahn等报道环状RNA能够转移到外泌体中[2]；同一年研究者又发现外泌体中的环状RNA具有富集和稳定的特点，是很有潜力的癌症诊断标记物[3]。然而，Oncogene突变对细胞以及细胞外泌体中环状RNA表达的影响还没有报道过。

研究目的：研究KRAS突变细胞系和细胞分泌外泌体中环状RNA的表达情况。

研究思路：一方面，通过RNA-Seq和生信流程分析KRAS突变型（DKO-1）、野生型（DKs-8）以及突变/野生混合型（DLD-1）三种结肠癌细胞系中的环状RNA（每组2个生物学重复）；

另一方面，分别提取上述三种细胞培养上清液的外泌体，然后通过相同流程分析外泌体环状RNA（每组3个生物学重复）。

研究结果

• 三种结肠癌细胞系中的环状RNA

通过RNA-Seq和生物信息学分析，研究者将含有2个或以上的反向剪切back-splice reads认为是普通circRNA candidates；含有10个或以上的back-splice reads是高质量circRNA candidates。结果发现，每组细胞中都有几百个高质量circRNA candidates（表1），总计1620个高质量candidates，其中1395（86.1%）个在circBase中有注释。

因此研究者在细胞中发现了大量候选环状RNA，为了提高筛选效率，着重研究高质量候选环状RNA。

表1. 三种结肠癌细胞系中的环状RNA生信预测和鉴定

接着，发现KRAS突变型（DKO-1）和突变/野生混合型（DLD-1）比野生型（DKs-8）细胞系的环状RNA的整体表达丰度要低（图1）。说明Oncogene突变降低了细胞中环状RNA的表达。

图1. 三种结肠癌细胞系中的环状RNA的差异表达情况

此外，挑选了几个丰度较高的circRNA，进行RT-PCR表达验证，与RNA-Seq结果一致。同时发现circRNA与其host gene的表达不具有相似性（图2），这表明细胞中circRNA的表达具有独立性，与其host gene关系不大。

图2. RT-PCR验证3个细胞系中候选circRNA和host gene的表达量

• 外泌体中的环状RNA

RNA-Seq结果显示，每组外泌体三个重复中，高质量circRNA candidates数量差异较大，重复性不好（表2）。

表2. 三种结肠癌细胞系外泌体中的环状RNA生信预测和鉴定

野生型（DKs-8）细胞外泌体中7个丰度最高的circRNA在DKs-8细胞中也表达最高，表明细胞中的部分circRNA可以转移到外泌体中。然而，RT-PCR显示circRTN4在DLD-1细胞外泌体中高表达，而在DLD-1细胞中低表达，这些结果表明，细胞和其外泌体之间的分子运输是非常复杂的。

RT-PCR验证挑选的5种circRNA，发现只有三种在突变和野生型细胞外泌体中差异表达，呈现出与细胞的一致性；而其他两种没有明显的表达差异。此外，与细胞中的情况相同，外泌体中circRNA的表达与其host gene不相关，也呈现独立性（图3）。

图3. RT-PCR验证3个细胞系外泌体中候选circRNA和host gene的表达量

研究总结

目前，外泌体环状RNA研究值得注意的几个问题：

不同来源外泌体中环状RNA的数量和丰度：根据已发表的文献，血清外泌体中环状RNA数量较多，丰度较大，是较好的样本来源。本文中细胞分泌的外泌体环状RNA在3个生物学重复之间的丰度变化较大。因此，研究细胞外泌体环状RNA可以考虑3个以上的生物学重复。

外泌体的分离和鉴定：本文中研究者有一定的基础，前期已成功发表相关分离鉴定的文章，采用的是高速离心法分离和nanoparticle tracking analysis鉴定。因此，研究细胞外泌体环状RNA的前提是有分离和鉴定的前期工作。

本文中采取的是去核糖体的RNA-Seq，并且没有经过RNase R处理，可以比较环状和线性RNA的表达情况。

为了防止培养细胞中的病毒、细菌的污染以及胎牛血清的干扰，分析时分别比对相应数据库，排除非癌症细胞、非外泌体的分子。

为了提高检测效率，作者加大了测序深度，每个样本得到约~100百万级别的reads数。

本文中，在癌症细胞中发现了大量的circRNA candidates（≥ 2个back-splice reads），为了提高研究精度，作者提高了筛选要求，选择高质量的circRNA candidates（≥ 10个back-splice reads）进行后续实验。

细胞和细胞外泌体中环状RNA丰度不完全一致，表明细胞与其外泌体之间的分子转移运输存在一定复杂性，可能存在一定的生物学机制进行分子选择。
细胞和细胞外泌体中环状RNA表达丰度与其host gene关系不大，表达模式呈现一定独立性。

参考文献：

[1] Dou Y et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Sci Rep doi:10.1038/srep37982 (2016).

[2] Li Y. et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research, doi:10.1038/cr.2015.82 (2015).

[3] Bahn JH. et al. The Landscape of MicroRNA, Piwi-Interacting RNA, and Circular RNA in Human Saliva. Clinical chemistry 61, 221–230, doi: 10.1373/clinchem.2014.230433 (2015).

解读：基迪奥生物