今天通过一篇circRNA的ceRNA机制研究的文章，给大家介绍一下circRNA的ceRNA机制研究的思路和方法。

背景介绍

ceRNA（competing endogenous RNAs，竞争性内源RNA）假说，提供了RNA之间相互作用的一种新机制。microRNA能够通过与RNA序列上的结合位点结合从而导致功能RNA的沉默，反过来，具有相同microRNA结合位点的RNA分子能够竞争结合microRNA，从而实现两个RNA分子通过microRNA这个桥梁产生调控作用。ceRNA分子包括mRNA、lncRNA、circRNA以及假基因。

circRNAs（circular RNAs，环状RNA分子）是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。由于circRNA通常是由特殊的可变剪切产生的，所以超过80%的circRNA包含编码蛋白的外显子，与同源的mRNA具有大量的相同序列，能够与其互为ceRNA，作为海绵吸附microRNA。

测序分析

在“Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulatescell growth by sponging multiple miRNAs” 这篇文章中，作者首先利用6个正常组织（脑、结肠、心脏、肝、肺以及胃）和7个癌组织（膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肾癌以及前列腺癌）做了circRNA测序，以期筛选出癌相关的circRNA，然后利用circBase数据库，与先前研究中已经发现的circRNA进行比对，筛选出新的circRNA，并利用RefSeq对测出来的circRNA进行注释。

接下来从候选circRNA中挑选了一些进行PCR验证，其中包括利用Outward-facing primers（外显子两端向外的引物，在cricRNA 检测中中，如果能产生pcr产物，则说明其实环化的)，验证所筛选出来的确实是circRNA，而不是普通的线型RNA，以及在组织中验证circRNA的表达量。

丰度分析

基因丰度是指基因在一个基因组中的数量，对circRNA而言，一个host gene往往能产生多个circRNAs。基因丰度和启动子的强弱最终会决定基因的表达量。对于一个非编码RNA，如果它的基因丰度较高，说明它很可能在生物学过程中起到了重要作用。所以作者通过丰度分析最终锁定了circHIPK3作为进一步的研究对象，并通过PCR进一步验证了circHIPK3的表达量。接下来作者分析了circHIPK3的稳定性以及在细胞中的定位：提取细胞中的总RNA，利用Actinomycin D（转录抑制剂）抑制转录，从而检测细胞内RNA的半衰期，结果表明circHIPK3的半衰期超过24h；荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）结合qRT-PCR证明circHIPK3定位于细胞质中。

circHIPK3的形成机制

作者利用CRISPR/Cas9分别删减HIPK3的内含子序列以及HIPK3的外显子序列，发现前者并不影响circHIPK3的表达，而后者则会直接影响circHIPK3的表达，最终证明了circHIPK3来源于HIPK3的第二个外显子。

细胞功能验证

利用siRNA敲减circHIPK3能够抑制细胞增殖。

circHIPK3的ceRNA机制研究

首先利用利用AGO2的免疫纯化(IP)分析circHIPK3与microRNA结合的可能性。AGO2是RISC的核心组分，联系着miRNA和它们的mRNA靶位点。因此，在合适的条件下对AGO2的免疫纯化(IP)可以获得相互结合的miRNA和mRNA，从而识别miRNA的靶位点。还可以进行免疫荧光，检测三者复合物在细胞内的定位。

再利用荧光素酶报告基因实验结合PCR进行验证，结果表明circHIPK3相关的microRNAs确实能够抵制荧光素酶活性，故而microRNAs与circHIPK3之间存在相互作用。

随后利用TargetScan和PicTar这两个microRNA预测工具，分析microRNA的可能结合位点（可能存在多个结合位点），之后通过突变结合位点结合荧光素酶报告基因实验，进一步验证circHIPK3能够吸附microRNAs，以及是通过哪个结合位点结合的。

小结：这也是一个从测序出发，一步步筛选目标基因，进而进行功能和机制研究的文章，层层推进，逻辑严密，但是将每一步拆分之后，我们会发现整个研究并没有想像中的那么复杂。

来源：小张聊科研

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