非编码RNA是近年研究的热点，从小的siRNA，miRNA到长的LncRNA和circRNA，每一个都在疾病和发育过程中发挥了重要的作用。其中，lncRNA和circRNA的研究起步较晚，现有的研究多是通过高通量测序的方法，在某一疾病体系中寻找差异表达的lncRNA和circRNA，然后通过生物信息学的方法，预测它们可能参与的信号通路。

在预测lncRNA和circRNA的功能机制时，最常用的就是ceRNA分析。ceRNA（competing endogenousRNAs，竞争性内源RNA）是一种RNA与RNA分子间的调节机制。

microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA，包括lncRNA和circRNA等，可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。

由于ceRNA的预测相对简单，实验也并不复杂，一时间仿佛成为非编码RNA机制研究的捷径，ceRNA的研究发表呈现爆发趋势。

然而，想要真正做好ceRNA的研究并不轻松，也不存在“ceRNA机制已经做得太多，难发好文章”的潜规则，下面，小又就带大家解读Science及其子刊发表的ceRNA研究。

先来解读一篇Science的文章，发得高是因为——同样是ceRNA，但是效果完全不同！！！经典的ceRNA是指circRNA(或lncRNA),通过吸附miRNA,使miRNA不能靶向目的mRNA，从而使目的基因高表达，那么当敲低circRNA(或lncRNA)时，miRNA得到释放，目的mRNA的翻译受阻，基因表达降低。

然而！该研究发现环状RNA Cdr1as可以通过结合mir-7使其保持稳定，不被降解，从而发挥功能，在敲低Cdr1as后，mir-7也降低，目的基因的表达升高！

研究者通过对小鼠大脑的Ago2-HITSCLIP分析，发现Cdr1as可以特异性结合mir-7和miR-671。有趣的是，Cdr1as和mir-7的部分序列互补结合，却可以和miR-671的全序列结合，那么，mir-7可以被Cdr1as吸附，而miR-671却可以切割Cdr1as！

其次，利用CRISPR技术敲除Cdr1as后，发现miR-7明显下降，而其他基因则变化不明显，说明Cdr1as特异性影响与它结合的miRNA。

值得注意得是：研究者得到了Cdr1as KO的纯合小鼠，之后的实验结果均是体内in vivo的结果，而不是简单的用细胞系进行实验验证。

那么，为什么miR-7会在没有Cdr1as吸附后迅速降低呢？是Cdr1as的吸附稳定了miR-7吗？

带着这个问题，研究者检测了敲除Cdr1as后miR-7及其前体pre-miR-7的变化，发现pre-miR-7基本不变，而miR-7显著降低。这说明Cdr1as对miR-7的调节不是在转录水平，而是在转录后水平，Cdr1as通过吸附作用，使miR-7更稳定。

接下来，研究者探究了在Cdr1as敲除导致mir-7下调后，mir-7的靶基因的变化，通过RNAseq分析和western blot验证，发现大量的mir-7靶基因显著上调。这个结果表明Cdr1as通过吸附mir-7，稳定mir-7的存在，抑制mir-7靶基因的发挥功能。

最后就是表型实验了。研究者发现Cdr1as的缺失不会造成小鼠生理行为的太大改变，但是在噪音刺激下，Cdr1as的缺失使小鼠变得迟钝，类似人类的精神分裂症的表现。

该研究的亮点在于：

1.发现ceRNA的新机制！circRNA可以通过吸附miRNA，使miRNA变得稳定，从而降低靶基因的表达。

2.建立了完备的体内实验体系。利用小鼠模型解释了ceRNA的生理意义。

然而，Cdr1as是一个非常特殊的circRNA——有70多个mir-7的吸附位点。而目前鉴定的大部分circRNA和lncRNA不具有如此多的同一个miRNA的吸附位点，并且已报道的ceRNA研究，均发现circRNA和lncRNA对miRNA的吸附，会降低miRNA靶向目的基因的效率，而不是促进miRNA的稳定。
那么，对于这些circRNA和lncRNA，我们又该如何开展研究呢？下面，小又为大家解析一篇SCIENCE子刊——SCIENCE SIGNALING的研究：

研究者以乳腺癌为例，揭示lncRNA在肿瘤转移中的重要作用。通过对转移能力强的细胞进行测序，研究者发现长非编码RNA H19显著的高表达。在敲除H19后，细胞的转移能力显著下降。

由于lncRNA被报道可以发挥ceRNA的功能，研究者通过（划重点！）以下三个实验证明H19可以吸附mir-200b/c和let7b.

1.AGO2 RIP实验，证明AGO2结合H19, mir-200b/c和let7c

2.双荧光报告实验，证明H19可以吸附mir-200b/c和let7c。研究者细致地做了转染不同浓度H19的实验，发现荧光值确实随着H19的量变化。

3.敲低H19后，mir-200b/c和let7c的靶基因下调

综上，研究者证明了H19通过吸附mir-200b/c和let7c，促进肿瘤转移的机制。

看着很简单对不对？其实该研究还有一个亮点——揭示了H19在肿瘤转移的不同阶段（EMT和MET），通过吸附不同的miRNA发挥作用的机制。总的来说，ceRNA的套路是比较简单的，想要做出新意，还需要在该ceRNA说明的问题上多下功夫。

1.Yonghao Yu, and Yiwen Chen，The EmergingFunction and Mechanism of ceRNAs in Cancer，Trends in Genetics,review, , April 2016, Vol. 32, No. 4；

2. M. Piwecka et al.,Science10.1126/science.aam8526 (2017)；

3. Dong Xie，The lncRNA H19 mediatesbreast cancer cell plasticityduring EMT and MET plasticity bydifferentiallysponging miR-200b/c and let-7b，Science Signaling,10, eaak9557 (2017)。

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