随着去除核糖体测序技术深入发展，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，为此小编特别邀请技术部刘建宁老师，带大家一起探讨circRNA功能验证策略。

circRNA定量验证

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.1）。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，称之为divergent primer（如图1.1），而且设计的PCR product的长度越短越好，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。

图1. convergent primer vs divergent primer

为增强circRNA的验证效率，起始模版需满足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，电泳检测PCR product大小（如图2）。

图2 circRNA引物扩增结果

circRNA Northern blot验证

Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法，需围绕circRNA设计探针序列，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计，我们建议以下两点：1. 对于外显子环化circRNA，建议探针尽可能跨backsplice junction位点；2.对内含子环化circRNA，可围绕内含子区域设计探针。

验证策略：对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。

circRNA过表达

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章报道circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构（如图3）。

 图3 circRNA侧翼结构特征

基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

过表达策略：

1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；

2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

circRNA敲除

circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。

敲除策略：

1、外显子环化circRNA，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA，如图4所示；

2、内含子环化circRNA，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。

3、每个siRNA设计对应的对照，backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配，如图3所示。

图4 基于siRNA敲除策略

参考文献

New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.

Nature Structural&Molecular Biology (2015) doi:10.1038/nsmb.2959.

RNA (2013) 19:141–

Cell Reports (2015) 10, 170–