每天师兄都要刷刷pubmed，因为师兄最近得了一种不看文献心痒痒（这周组会该我了），不做实验不自在（不想留在实验室过年），不听老板谆谆教诲就不痛快（标书啊标书）的怪病，发现两篇好文跟大家分享。

CircRNA的研究技术路线该怎么规(chui)划(niu)，间隔一周发的两篇10分文章，咱们也来取取经。

（1）国自然热点

2017年申请到的circRNA项目是140+项

（2）一文了解circRNA的研究技术路线

咱们就拿其中一篇文章来研究一下吧

期刊：Ann Rheum Dis，13分

单位：上海第九人民医院矫形外科

疾病：腰椎间盘退变（IVDD）

前期实验设计思路：先讲miRNA→再讲mRNA→最后circRNA→细胞模型+大鼠模型→IVDD

故事梗概1、2、3、4、5：

Step 1：选择细胞模型和动物模型

发现临床问题后，确定细胞和动物模型，在细胞、动物模型中来建立临床问题和科学假说的直接联系。
可以取组织或者器官最丰富或者最重要的细胞系或者原代细胞，进行传代培养，例如这里面是Nucleus pulposus cell（髓核细胞），一种在腰间盘最丰富的细胞类型，而且分泌多种细胞外基质+细胞因子，调控腰间盘的微环境。
动物模型：IVD大鼠模型

Step 2：先从哪个分子着手呢？miRNA！

mRNA？miRNA？CircRNA？

先从miRNA入手吧，上可找circ，下可寻mRNA。

呵呵，没钱测序？GEO里有啊，GSE45856。

三个miRNA上调表达，为啥要选上调的？做表型会稍微容易些。

那接下来就是一顿围绕miR-200c的操作了：

Q-PCR、Northern blot：在病人的组织样本中验证一下表达量；

miRNA的拮抗剂和mimics：正常细胞株中转染miR-200C mimics→细胞凋亡检测→凋亡相关蛋白的WB以及Q-PCR实验←细胞凋亡检测←miR-200C拮抗剂；

Step 3：mRNA？CircRNA？→mRNA！

可以选择先讲下游的调控机制：miRNA的下游靶基因

咱们上面说到，正常细胞转染mimics后出现了凋亡。

接下来就是miRNA靶基因预测神器：Starbase

①预测的几百个基因→DAVID的GO和KEGG→凋亡信号通路相关的mRNA若干→XIAP等凋亡基因

②miRNA调控靶基因mRNA的表达验证：

荧光素酶报告实验（XIAP的结合位点突变）→证明miRNA功能上结合该位点并调控mRNA丰度；

细胞模型中转染miRNA的拮抗剂和mimics→WB、Q-PCR检测靶基因XIAP的表达→Rescue实验敲减靶基因→细胞凋亡检测、凋亡蛋白markers检测

Step 4：CircRNA！

怎么预测miRNA的上游circRNA呢？万能的神器starbase！

还真别说就是这么好用！

又是一顿互作的操作和表型检测

①证明该circRNA确实存在，且和其他转录本区分开：PCR、样本验证、FISH定位

②cricRNA的敲减和过表达：miRNA、mRNA的表达量以及细胞凋亡检测

③证明该circRNA和miRNA互作：CLIP sequence，IP-pulldown、FISH定位

CLIP测序:检测circRNA中有几个miRNA的结合位点！

AGO2的RIP实验：AGO2“筹划”了RISCs（里面含有miR-200c）对于目标mRNA的切割过程，那么对纯化产物做circRNA的Q-PCR，就可以评估circRNA和miRNA互作深度：

Step 5：大鼠体内验证circRNA的功能

因为病变组织中，circRNA是低表达的，这时候就需要在大鼠模型中的腰间盘里过表达circRNA了：检测是否转染成功、镜检腰间盘病例切片分期

好了，circRNA研究路线会设计了吧！

最后不要忘记假说机制图啊！

文章：小张聊科研|微信公众号