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1月31日,江苏省人民医院泌尿外科吕强教授和杨海伟作为共同通讯作者,在Molecular Cancer杂志发表题为:Circular RNA circ-ITCH inhibits bladder
cancer progression by sponging miR-17/miR-224 and regulating p21, PTEN
expression的研究文章。

 

按做过的统计(统计截至2017年12月8日),circRNA研究的文章都发在了哪些杂志?有哪些最值得读?

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图2

 

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图3:一篇6分的circRNA文章还是很难的

 

那我们来看看这篇Mol Cancer的文章是怎么做的

 

深知每一篇文章背后的艰辛,本文所做分析是为读者提供更清晰的理解。

 

一、研究方向

 

研究circRNA在膀胱癌(BCa)中的作用。作者是泌尿外科的,研究膀胱癌没毛病。

 

二、circRNA的确定

 

目前很少有研究描述circRNA在BCa中的作用,(所以值得研究)。circ-ITCH在结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、肺癌和肝细胞癌中表达下调,并通过经典的miRNA海绵作用作为一种肿瘤抑制剂,(所以circ-ITCH在BCa中很可能也有肿瘤抑制作用)

 

三、提出猜想

 

根据已有研究,circ-ITCH作为miRNA海绵起作用,circ-ITCH保护其母基因ITCH并阻断下游的Wnt/β-连环蛋白信号传导,导致阻止肿瘤进展。

 

作为单独的细胞周期依赖性激酶抑制剂或著名的肿瘤抑制因子,p21和磷酸酶和PTEN被证实是调节BCa的关键分子。 p21缺失与BCa进展相关,而PTEN缺失与侵袭性肿瘤表型和不良预后有关,这两者都是BCa是关键的治疗靶标。

 

此外,早期研究表明,多种致癌miRNA通过中和p21或PTEN表达来促进肿瘤的恶性肿瘤。

 

通过生物信息学分析,发现p21,PTEN的3’UTR和circ-ITCH共享miR-17和miR-224的结合位点,也就是BCa中circ-ITCH与p21 / PTEN之间很可能存在关联。

 

考虑到circRNA主要作为miRNA海绵发挥其功能,因此,提出了一个假设:circ-ITCH可能通过影响miRNA介导的方式影响p21和PTEN的表达而参与BCa进展。(猜想的逻辑很清晰,还是要多看文献啊)

 

四、验证猜想

 

提出猜想后,就是验证猜想了。

 

Circ-ITCH在BCa中表达降低并与BCa患者的预后相关

 

circ-ITCH在BCa中显着降低,并与BCa患者的预后相关.

a和b.circ-ITCH在BCa组织中的表达明显低于癌旁正常组织;

c.与SV-HUC相比,在8个BCa细胞系(EJ,T24,253 J,RT4,TCC SUP,UMUC,J82,5637)中circ-ITCH显示较低的表达;

d.BCa细胞系EJ和T24中过表达circ-ITCH;

e.circ-ITCH表达水平与BCa患者总体存活的相关性。

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circ-ITCH体外抑制BCa细胞的进展

 

circ-ITCH的过表达抑制膀胱癌细胞生长、克隆形成、迁移和侵袭。

 

a和b.circ-ITCH抑制细胞增殖;

c和d.Transwell侵袭实验,circ-ITCH抑制细胞侵袭和迁移;

e和f.细胞划痕实验,circ-ITCH降低细胞划痕愈合;

g和h.circ-ITCH抑制EJ和T24细胞的克隆形成。

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circ-ITCH诱导BCa细胞的细胞周期停滞和细胞凋亡。

 

a.流式细胞实验分析细胞周期;

b.circ-ITCH在G1/S期阻滞EJ和T24细胞周期,而miR-17和miR-224转变G1/S期;

c.在EJ和T24中的凋亡检测;

e.细胞凋亡检测显示,EJ和T24细胞凋亡率增加

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circ-ITCH充当miR-17和miR-224的分子海绵

 

circ-ITCH充当miR-17和miR-224的海绵。

 

a.BCa细胞裂解中的circ-ITCH被拉下并用circ-ITCH特异性探针富集,然后通过qRT-PCR检测;

b.将miR-17拉下并用circ-ITCH特异性探针富集,然后通过qRT-PCR检测;

c.将miR-224拉下并用circ-ITCH特异性探针富集,然后通过qRT-PCR检测;

d和f.生物素偶联的miRNA和偶联的NC的对比;

e和g.使用qRT-PCR检测d和f的产物,然后进行琼脂糖凝胶电泳;

h和i.RNA FISH实验,miR-17和miR-224与细胞质中的cir-ITCH共定位,细胞核染成蓝色(DAPI),circ-ITCH染成红色,miR-17/miR-224染成绿色。

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miR-17和miR-224促进BCa细胞增殖

 

miR-17和miR-224作为BCa中的致癌基因起作用并消除了cir-ITCH的阻遏功能。

 

a和b.miR-17和miR-224在BCa组织中比相邻正常组织中表达上调;

c和d.使用Pearson相关分析显示cir-ITCH和miR-17/miR-224表达之间呈中度负相关;

e和f.CCK-8检测显示miR-17和miR-224促进了EJ细胞的活力;

g.克隆形成实验表明miR-17和miR-224在会增加EJ细胞克隆数量;

h.miR-17和miR-224逆转了circ-ITCH对细胞增殖的抑制作用。

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circ-ITCH调控miR-17(或miR-224)靶向p21和PTEN

 

circ-ITCH调节靶向p21和PTEN的内源性miR-17和miR-224的表达。

 

a.预测的miR-17 / miR-224结合序列在p21和PTEN mRNA的3′-UTR中;

b和c.circ-ITCH上调BCa细胞中p21和PTEN的mRNA表达水平;

d.circ-ITCH上调BCa细胞中p21和PTEN的蛋白表达水平;

e和f.miR-17和miR-224分别降低了p21和PTEN的蛋白表达水平;

g和h.双荧光素酶报告基因检测证明p21和PTEN是miR-17的直接靶标;

i和j.双荧光素酶报告基因检测证明p21和PTEN是miR-224的直接靶标;

k和i.WB检测显示miR-17和miR-224可部分降低cir-ITCH对p21和PTEN的蛋白表达的促进。

m.circ-ITCH-miR-17/miR-224-p21/PTEN调控网络图

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circ-ITCH在体内抑制异种移植肿瘤的生长

 

circ-ITCH在裸鼠中抑制异种移植物的肿瘤形成。

 

a.用T24细胞注射的裸鼠的代表性图像;

b.裸鼠异种移植瘤形成;

c.每周测量的小鼠的肿瘤体积;

d.使用电子秤测量两组肿瘤重量;

e.从肿瘤中提取蛋白质,WB检测p21/PTEN的蛋白质表达;

f.免疫组化染色在肿瘤中检测p21 / PTEN的表达。

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文章:微信公众号“bioword”

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