前言：环状RNA (circRNA)是一种新兴、广泛存在、丰富且进化保守的非编码RNA。它们在细胞发育、生长和肿瘤形成过程中发挥着重要而多样的作用。为了研究circRNA功能，需要对其表达进行调控。

虽然某些circRNA在细胞中高表达，但大多数还是低表达的。因此，过表达circRNA是研究其功能的有力方法。

首先，互补序列介导的RNA环化是circRNA过表达的经典策略。其次，将Quaking的RNA结合基序插入侧接所需外显子的内含子有助于circRNA的生物发生。另外，还使用过基于tRNA的剪接机制来过表达circRNA。然而，这些方法存在一些缺点，例如表达效率低，构造载体复杂且耗时长，需要在目的细胞中表达RNA结合蛋白，以及不准确的circRNA剪接等，这些都限制了它们在circRNA功能研究中的应用。因此，仍然需要一种方便，高效，准确的circRNA表达系统。

为了实现这一目标，我们提出了经典的互补序列介导的高拷贝数circRNA表达的circRNA环化的修订版。circRNA表达盒由三部分组成：两个反向互补序列（每个约800bp）由特定基因的上游内含子组成，环形RNA形成外显子，其两侧是特定的上游和 下游内含子序列（每个约200bp）保留剪接识别和聚嘧啶束（PPT）。插入circRNA外显子下游的上游内含子在转录后产生稳定的RNA发夹结构，促进外显子剪接成环状RNA。通过将所需的circRNA序列插入到互补内含子序列之间的多克隆位点（MCS）中，该载体可以用作表达各种circRNA的通用载体（图1）。

载体图谱，该载体骨架是pcDNA3.1

以此载体构建的circRNA表达水平比内源性水平高400-5000倍，转化效率高于55％，副产物降至最低。

表达效果验证

高效表达circRNA载体protocol部分截图

文章：bioworld 微信公众号